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公开(公告)号：CN118703423A
公开(公告)日：2024-09-27
申请号：CN202410961165.9
申请日：2024-07-17
Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所(中国动物卫生与流行病学中心兰州分中心)
IPC: C12N5/071 , C12N5/0786 , C12N7/00 , C12N7/02 , C12R1/91
Abstract: 本发明公开了一种高效分离非洲猪瘟病毒的PAMs/WSh细胞及其分离方法与应用，本发明在常规分离PAMs细胞并重悬后，依次用不同孔径细胞筛过滤除杂、用不含RNA酶的无核酸酶水在20 s内重悬，然后加入含90%胎牛血清+10%的DMSO的细胞冻存液冻存；复苏细胞时先用含两性双抗和庆大双抗RPMI‑1640培养基混悬细胞，过滤离心后用含两性双抗和庆大双抗、12%胎牛血清的1640培养基重悬后培养6‑8 h，接毒，收毒时间为4‑5 d。通过排除红细胞干扰、去除可能存在的细胞团或碎片、筛选目标细胞大小的单细胞悬液，提高了细胞活力，提升了病毒分离率和拷贝数，同时也克服了细胞冻存周期短的问题，获得的PAMs/WSh细胞为非洲猪瘟病毒的高效分离及病毒感染致病机制研究提供了有利工具。
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公开(公告)号：CN116574848A
公开(公告)日：2023-08-11
申请号：CN202310732068.8
申请日：2023-06-20
Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC: C12Q1/70 , C12Q1/6844 , C12Q1/6806 , C12N15/11 , C12R1/93
Abstract: 本发明公开了一种基于LAMP‑CRISPRCas12a检测猪圆环2型病毒的引物及检测方法，包括以下操作步骤：(1)组织样品的处理；(2)病毒DNA的提取；(3)引物设计；(4)PCR产物回收及纯化；(5)标准质粒的构建；(6)重组质粒鉴定；(7)质粒DNA小量抽提；(8)LAMP引物筛选及扩增；(9)猪圆环病毒2型LAMP‑CRISPR‑Cas12a检测体系建立；本发明在CRISPR技术的基础上与LAMP技术相结合，建立了PCV2的快速检测方法，该方法敏感性高、特异性高、操作简单、检测时间短、结果分析简单、抗干扰性强、不需要复杂仪器设备。这种低价、高度敏感和特异性强、便携式和可视化的方法将是现场PCV2检测的替代方法，这可能有助于及时监测和快速制定控制PCV2的策略。
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公开(公告)号：CN115644165A
公开(公告)日：2023-01-31
申请号：CN202210780307.2
申请日：2022-07-05
Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC: A01N1/02
Abstract: 本发明公开一种用于保存动反刍动物食道‑咽部分泌物（O‑P液）药物。本发明的合物包括：磷酸二氢钾0.08g～0.24g、磷酸氢二钠、0.46g～1.44g、氯化钠2.7g～8.0g、氯化钾、0.05g～0.2g，和酚红0.01g～0.5g。本发明的组合物为固体，稳定性更高，可常规温度保存更长时间，具有携带方便，价格低廉的优点，并可指示采集样品是否成功，可大大提高采集样品的效率，从而提高样品一次检测通过的概率，最终在实际工作中取得更好的经济效益。
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公开(公告)号：CN111793650A
公开(公告)日：2020-10-20
申请号：CN202010651532.7
申请日：2020-07-08
Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC: C12N15/866 , C12N15/62 , A61K39/295 , A61K39/135 , A61K39/23 , A61P31/14 , A61P31/20
Abstract: 本发明根据计算机软件模拟结果，在猪细小病毒PPV VP2蛋白Loop2区和Loop4区后嵌入SAT2FMDV B细胞表位(VYTKAAAAIRGDRAALAAKYADTNHTLPPTFNFGYVTVDK)，N端嵌入两个T细胞表位(NVQEGRRKHTDVAFLLDRST)串联。根据昆虫细胞嗜性优化合成嵌合基因GS1927OP，克隆到载体pFastBacTMDual上，转化感受态细胞DH10Bac，获得重组杆粒rBacmidN(T1)2L2B4B，转染sf9细胞收获重组杆状病毒rBacN(T1)2L2B4B，用其感染HF细胞，使用间接免疫荧光IFA针对嵌合表位和VP2蛋白进行检测，具有特异性荧光。Western-blot针对B、T细胞表位和VP2蛋白进行检测，在72KDa出现一条特异性条带。透射电镜TEM观察，重组蛋白N(T1)2L2B4B能够自我组装成病毒样颗粒。本发明旨在为南非2型口蹄疫制备储备疫苗，并能在此基础上达到同时预防南非2型口蹄疫和猪细小病的目的。
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公开(公告)号：CN114924069A
公开(公告)日：2022-08-19
申请号：CN202210524481.0
申请日：2022-05-13
Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC: G01N33/569 , G01N33/543 , C12Q1/6804 , C12Q1/70 , C12N15/11 , C12R1/93
Abstract: 本发明公开了一种基于单域抗体9‑4‑2免疫磁珠的直扩检测山羊痘病毒的试剂盒及其应用。所述试剂盒包括SEQIDNO.1所示的山羊痘病毒单域抗体9‑4‑2通过链霉亲和素‑生物素与磁珠进行偶联得到的单域抗体9‑4‑2免疫磁珠。本发明使用切胶纯化的单域抗体9‑4‑2蛋白与磁珠进行偶联获得免疫磁珠，免疫磁珠富集山羊痘病毒后，无需提取基因组RNA，可直接对其进行扩增。本发明的提出克服了山羊痘病毒由于形成夹皮时间久，不容易在病毒复制高峰期发现，采集病料病毒含量低微，所以检出率低，容易漏检等现象；以及提取基因组DNA时费时、费财、费力，操作时污染环境等一系列难题，而且高效、灵敏、特异、稳定、实用，本发明的提出为山羊痘病毒病的检测提供了一种高效的技术手段。
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公开(公告)号：CN114895027B
公开(公告)日：2025-04-08
申请号：CN202210523485.7
申请日：2022-05-13
Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC: G01N33/569 , G01N33/543 , C07K16/10 , C12Q1/70 , C12Q1/6844 , C12R1/93
Abstract: 本发明公开了一种基于单域抗体9‑4‑①免疫磁珠的直扩检测小反刍兽疫病毒的试剂盒及其应用。所述试剂盒包括SEQIDNO.1所示的小反刍兽疫病毒单域抗体9‑4‑①通过链霉亲和素‑生物素与磁珠进行偶联得到的单域抗体9‑4‑①免疫磁珠。本发明使用切胶纯化的单域抗体9‑4‑①蛋白与磁珠进行偶联获得免疫磁珠，免疫磁珠富集小反刍兽疫病毒后，无需提取基因组RNA，可直接对其进行扩增。本发明的提出克服了由于病毒含量低微，检出率低，容易漏检等问题；以及提取基因组RNA时费时、费财、费力，操作时污染环境等一系列难题，通过直接扩增富集产物不但节约时间、节省资源，而且高效、灵敏、特异、稳定，本发明的提出为小反刍兽疫病毒抗原的检测提供了一种高效的技术手段。
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公开(公告)号：CN111826468A
公开(公告)日：2020-10-27
申请号：CN202010787402.6
申请日：2020-08-07
Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC: C12Q1/70 , C12Q1/6851 , C12N15/11 , C12R1/93
Abstract: 本发明涉及一步法检测1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物探针组和试剂盒，属于病毒检测技术领域。本发明所述引物探针组，包括正向引物、反向引物和探针，所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述探针为在SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的5'端修饰有荧光基团、3'端修饰有猝灭基团的物质。应用本发明所述引物探针组进行检测具有良好的特异性和敏感性，与2型猪繁殖与呼吸综合征没有任何反应，具有很好的临床应用价值。
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公开(公告)号：CN111778220A
公开(公告)日：2020-10-16
申请号：CN202010651533.1
申请日：2020-07-08
Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC: C12N7/01 , C12N15/866 , C07K19/00 , A61K39/295 , A61K39/125 , A61K39/135 , A61P31/14 , A61P31/20 , C12R1/93
Abstract: 本发明根据计算机软件模拟结果，在猪细小病毒PPV VP2蛋白Loop2区嵌入SAT2 FMDV B细胞表位(VYTKAAAAIRGDRAALAAKYADTNHTLPPTFNFGYVTVDK)，N端嵌入T细胞表位(NVQEGRRKHTDVAFLLDRST)。根据昆虫细胞嗜性优化合成嵌合基因GS1923OP，克隆到载体pFastBacTMDual上，转化感受态细胞DH10Bac，获得重组杆粒rBacmidNT1L2B，转染sf9细胞，收获重组杆状病毒rBacNT1L2B，用其感染HF细胞，使用间接免疫荧光IFA针对嵌合表位和VP2蛋白进行检测，具有特异性荧光。We stern-blot针对B、T细胞表位和VP2蛋白进行检测，在67KDa出现一条特异性条带。透射电镜TEM观察，重组蛋白NT1L2B能够自我组装成病毒样颗粒。本发明可应用在为南非2型口蹄疫制备储备疫苗，并能在此基础上达到同时预防南非2型口蹄疫和猪细小病的目的。
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公开(公告)号：CN110862437A
公开(公告)日：2020-03-06
申请号：CN201911166768.5
申请日：2019-11-25
Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所
Inventor： 丁耀忠 , 汪洋 , 李国秀 , 马维民 , 何继军 , 李茜 , 爱斯纳非.科友斯.伍赛特 , 代军飞 , 张杰 , 侯谦 , 马炳 , 李小云 , 刘永生 , 孙跃峰 , 吕建亮 , 邵军军 , 王永录 , 张忠旺 , 张永光
Abstract: 本发明公开了一种南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法，以南非2型口蹄疫病毒基因组(JX014256)为参考序列，在FMDV SAT2的VP1蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因，然后在SUMO的上游引入6个His标签编码基因，再根据大肠杆菌密码子嗜性，优化HisSUMO-SAT2-VP1基因，重组至PUC57质粒，以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57质粒为模板，设计特异性引物；PCR扩增后利用相同的限制性内切酶酶切目的片段与表达载体，将目的基因克隆入pET32a(+)原核表达载体，构建重组质粒pET32a-HisSUMO-VP1，转入大肠杆菌诱导表达，利用镍柱进行纯化。结果表明HisSUMO-VP1蛋白在大肠杆菌中能可溶性表达，纯化后的目的蛋白具有较好的免疫原性。本发明充分利用His与SUMO标签的优点，不仅提高Ni与组氨酸结合的特异性和稳定性，而且提高重组蛋白纯化效率。
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公开(公告)号：CN114924069B
公开(公告)日：2025-04-08
申请号：CN202210524481.0
申请日：2022-05-13
Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC: G01N33/569 , G01N33/543 , C12Q1/6804 , C12Q1/70 , C12N15/11 , C12R1/93
Abstract: 本发明公开了一种基于单域抗体9‑4‑2免疫磁珠的直扩检测山羊痘病毒的试剂盒及其应用。所述试剂盒包括SEQIDNO.1所示的山羊痘病毒单域抗体9‑4‑2通过链霉亲和素‑生物素与磁珠进行偶联得到的单域抗体9‑4‑2免疫磁珠。本发明使用切胶纯化的单域抗体9‑4‑2蛋白与磁珠进行偶联获得免疫磁珠，免疫磁珠富集山羊痘病毒后，无需提取基因组RNA，可直接对其进行扩增。本发明的提出克服了山羊痘病毒由于形成夹皮时间久，不容易在病毒复制高峰期发现，采集病料病毒含量低微，所以检出率低，容易漏检等现象；以及提取基因组DNA时费时、费财、费力，操作时污染环境等一系列难题，而且高效、灵敏、特异、稳定、实用，本发明的提出为山羊痘病毒病的检测提供了一种高效的技术手段。
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