公开(公告)号：CN110845580A

公开(公告)日：2020-02-28

申请号：CN201911072955.7

申请日：2019-11-05

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 汪洋 ,  丁耀忠 ,  李茜 ,  张杰 ,  爱斯纳非.科友斯.伍赛特 ,  代军飞 ,  李国秀 ,  侯谦 ,  马炳 ,  刘永生 ,  吕建亮 ,  邵军军 ,  刘新生 ,  孙跃峰 ,  潘丽 ,  张永光

IPC: C07K14/015 ,  C12N15/35 ,  C12N15/866 ,  G01N33/569

Abstract: 本发明属于基因组装及免疫原性鉴定技术领域，公开了一种猪细小病毒样颗粒的组装及其免疫原性鉴定方法，包括VP2基因的扩增，优化及重组供体质粒的构建；VP2重组穿梭质粒的构建与鉴定；重组杆状病毒的获得与鉴定；Western-blot鉴定VP2蛋白的表达；VP2蛋白的间接免疫荧光鉴定；PPV-AV30病毒纯化及鉴定；病毒样颗粒的组装及鉴定。本发明对蛋白进行翻译后加工修饰，展示目的蛋白的天然构象；本发明成功表达了PPV毒株AV-30的蛋白VP2，并且正确组装成了VLPs，与天然病毒粒子PPV-AV30相似，为下一步研究基于VLPs的亚单位疫苗或者制备嵌合型VLPs奠定了基础。

公开(公告)号：CN110862437A

公开(公告)日：2020-03-06

申请号：CN201911166768.5

申请日：2019-11-25

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 丁耀忠 ,  汪洋 ,  李国秀 ,  马维民 ,  何继军 ,  李茜 ,  爱斯纳非.科友斯.伍赛特 ,  代军飞 ,  张杰 ,  侯谦 ,  马炳 ,  李小云 ,  刘永生 ,  孙跃峰 ,  吕建亮 ,  邵军军 ,  王永录 ,  张忠旺 ,  张永光

IPC: C07K14/09 ,  C07K1/22 ,  C12N15/42 ,  C12N15/70

Abstract: 本发明公开了一种南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法，以南非2型口蹄疫病毒基因组(JX014256)为参考序列，在FMDV SAT2的VP1蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因，然后在SUMO的上游引入6个His标签编码基因，再根据大肠杆菌密码子嗜性，优化HisSUMO-SAT2-VP1基因，重组至PUC57质粒，以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57质粒为模板，设计特异性引物；PCR扩增后利用相同的限制性内切酶酶切目的片段与表达载体，将目的基因克隆入pET32a(+)原核表达载体，构建重组质粒pET32a-HisSUMO-VP1，转入大肠杆菌诱导表达，利用镍柱进行纯化。结果表明HisSUMO-VP1蛋白在大肠杆菌中能可溶性表达，纯化后的目的蛋白具有较好的免疫原性。本发明充分利用His与SUMO标签的优点，不仅提高Ni与组氨酸结合的特异性和稳定性，而且提高重组蛋白纯化效率。

公开(公告)号：CN113564276A

公开(公告)日：2021-10-29

申请号：CN202110550305.X

申请日：2021-05-19

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 汪洋 ,  张杰 ,  侯谦 ,  马维民 ,  何继军 ,  代军飞 ,  李茜 ,  李苗苗 ,  爱斯纳非.科友斯.伍赛特 ,  陈达年 ,  丁耀忠 ,  刘永生 ,  张永光

IPC: C12Q1/70 ,  C12Q1/6844 ,  C12N15/11

Abstract: 本发明公开了FMDV可视化RT‑LAMP检测方法的建立。以合成的39条3D‑T7序列的体外RNA转录本为模板，对RT‑LAMP引物、引物浓度、反应时间、反应温度和显色剂等进行了筛选。建立了FMDV的RT‑LAMP检测方法，总体系为20μL，包括RT‑LAMP缓冲液15.2μL，BstAMV酶混合液1.5μL，外引物F3和B3各0.04μL(100μM)，内引物FIP和BIP各0.5μL(100μM)，环引物Floop和Bloop各0.11μL(100μM)，中性红1μL(500μM)，模板1μL。反应时间55min，反应温度65℃。反应结束后，若反应管溶液变为粉红色判为阳性，若为橘黄色则判为阴性。该方法特异性强，不与BVDV、ORFV、SPPV/GTPV、SVDV、BTV、PRRSV、CSFV、PRV、PPV和PCV等病毒发生反应。建立的FMDV可视化RT‑LAMP方法为基层现场检测奠定了基础，以达到快速诊断FMDV的目的。