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公开(公告)号：CN111087452A
公开(公告)日：2020-05-01
申请号：CN201911309242.8
申请日：2019-12-18
Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所
Abstract: 本发明公开了一种猪圆环病毒2b亚型Cap蛋白的原核可溶性表达方法，以PCV2毒株基因组为参考序列，在PCV2b的Cap蛋白编码基因上游偶联SUMO促溶表达标签编码基因，在SUMO的上游引入6个His标签编码基因，优化基因，重组至PUC57质粒，以重组质粒为模板，设计特异性引物，经PCR扩增后产物克隆入pMAL-C4x原核表达载体，构建重组质粒，转入大肠杆菌进行诱导、纯化。本发明成功构建了pMAL-MBP-HisSUMO-Cap重组表达载体，MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白在BL21(DE3)中可实现可溶性表达，纯化后MBP-HisSUMO-Cap融合蛋白作为免疫原，能与PCV2b阳性猪血清、兔抗MBP-tag多克隆抗体和免疫小鼠抗血清均能发生特异性反应，表明其具有较好的免疫原性，为PCV2b诊断试剂盒的研发奠定了理论基础。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN110845580A
公开(公告)日：2020-02-28
申请号：CN201911072955.7
申请日：2019-11-05
Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所
Inventor： 汪洋 , 丁耀忠 , 李茜 , 张杰 , 爱斯纳非.科友斯.伍赛特 , 代军飞 , 李国秀 , 侯谦 , 马炳 , 刘永生 , 吕建亮 , 邵军军 , 刘新生 , 孙跃峰 , 潘丽 , 张永光
IPC: C07K14/015 , C12N15/35 , C12N15/866 , G01N33/569
Abstract: 本发明属于基因组装及免疫原性鉴定技术领域，公开了一种猪细小病毒样颗粒的组装及其免疫原性鉴定方法，包括VP2基因的扩增，优化及重组供体质粒的构建；VP2重组穿梭质粒的构建与鉴定；重组杆状病毒的获得与鉴定；Western-blot鉴定VP2蛋白的表达；VP2蛋白的间接免疫荧光鉴定；PPV-AV30病毒纯化及鉴定；病毒样颗粒的组装及鉴定。本发明对蛋白进行翻译后加工修饰，展示目的蛋白的天然构象；本发明成功表达了PPV毒株AV-30的蛋白VP2，并且正确组装成了VLPs，与天然病毒粒子PPV-AV30相似，为下一步研究基于VLPs的亚单位疫苗或者制备嵌合型VLPs奠定了基础。
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公开(公告)号：CN110951757A
公开(公告)日：2020-04-03
申请号：CN201911168275.5
申请日：2019-11-25
Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所
Abstract: 本发明公开了一种南非2型口蹄疫病毒VP3基因的原核可溶性表达方法，根据南非2型口蹄疫病毒基因序列，在FMDV SAT2的VP3蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因，然后在SUMO的上游引入6个His标签编码基因，再根据大肠杆菌密码子嗜性，优化HisSUMO-SAT2-VP3基因，重组至PUC57质粒，以HisSUMO-SAT2-VP3-PUC57质粒为模板，设计扩增南非2型口蹄疫病毒VP3基因的特异性引物，PCR扩增后用相同的限制性内切酶酶切目的片段与表达载体，之后将目的基因克隆入pET32a(+)原核表达载体，构建重组质粒pET32a-HisSUMO-VP3，转入大肠杆菌进行表达并对重组蛋白进行纯化。本发明成功构建了pET32a-HisSUMO-VP3原核表达载体，实现了在大肠杆菌中的表达，纯化后的目的蛋白具有较好的反应原性，为后续南非2型口蹄疫病毒亚单位疫苗的组装奠定基础。
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公开(公告)号：CN110862437A
公开(公告)日：2020-03-06
申请号：CN201911166768.5
申请日：2019-11-25
Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所
Inventor： 丁耀忠 , 汪洋 , 李国秀 , 马维民 , 何继军 , 李茜 , 爱斯纳非.科友斯.伍赛特 , 代军飞 , 张杰 , 侯谦 , 马炳 , 李小云 , 刘永生 , 孙跃峰 , 吕建亮 , 邵军军 , 王永录 , 张忠旺 , 张永光
Abstract: 本发明公开了一种南非2型口蹄疫病毒VP1基因的可溶性表达方法，以南非2型口蹄疫病毒基因组(JX014256)为参考序列，在FMDV SAT2的VP1蛋白编码基因上游直接偶联SUMO促溶表达标签编码基因，然后在SUMO的上游引入6个His标签编码基因，再根据大肠杆菌密码子嗜性，优化HisSUMO-SAT2-VP1基因，重组至PUC57质粒，以HisSUMO-SAT2-VP1-PUC57质粒为模板，设计特异性引物；PCR扩增后利用相同的限制性内切酶酶切目的片段与表达载体，将目的基因克隆入pET32a(+)原核表达载体，构建重组质粒pET32a-HisSUMO-VP1，转入大肠杆菌诱导表达，利用镍柱进行纯化。结果表明HisSUMO-VP1蛋白在大肠杆菌中能可溶性表达，纯化后的目的蛋白具有较好的免疫原性。本发明充分利用His与SUMO标签的优点，不仅提高Ni与组氨酸结合的特异性和稳定性，而且提高重组蛋白纯化效率。
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公开(公告)号：CN111793650A
公开(公告)日：2020-10-20
申请号：CN202010651532.7
申请日：2020-07-08
Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所
IPC: C12N15/866 , C12N15/62 , A61K39/295 , A61K39/135 , A61K39/23 , A61P31/14 , A61P31/20
Abstract: 本发明根据计算机软件模拟结果，在猪细小病毒PPV VP2蛋白Loop2区和Loop4区后嵌入SAT2FMDV B细胞表位(VYTKAAAAIRGDRAALAAKYADTNHTLPPTFNFGYVTVDK)，N端嵌入两个T细胞表位(NVQEGRRKHTDVAFLLDRST)串联。根据昆虫细胞嗜性优化合成嵌合基因GS1927OP，克隆到载体pFastBacTMDual上，转化感受态细胞DH10Bac，获得重组杆粒rBacmidN(T1)2L2B4B，转染sf9细胞收获重组杆状病毒rBacN(T1)2L2B4B，用其感染HF细胞，使用间接免疫荧光IFA针对嵌合表位和VP2蛋白进行检测，具有特异性荧光。Western-blot针对B、T细胞表位和VP2蛋白进行检测，在72KDa出现一条特异性条带。透射电镜TEM观察，重组蛋白N(T1)2L2B4B能够自我组装成病毒样颗粒。本发明旨在为南非2型口蹄疫制备储备疫苗，并能在此基础上达到同时预防南非2型口蹄疫和猪细小病的目的。
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公开(公告)号：CN111020059A
公开(公告)日：2020-04-17
申请号：CN201911309233.9
申请日：2019-12-18
Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所
Abstract: 本发明公开了一种猪圆环病毒3型的PCR检测方法，根据猪圆环病毒3型(PCV3)的保守基因区段筛选出特异性引物，建立PCR检测方法，所得目的基因扩增片段大小为457bp。建立的PCV3 PCR不与猪圆环病毒2型、1型和2型猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪乙脑病毒、古典猪瘟病毒和非洲猪瘟病毒发生交叉反应，可用以了解样品采集地猪群PCV3的感染情况，经敏感性和特异性检测分析表明建立的PCV3 PCR检测方法具有良好的特异性和敏感性，可用于田间样品的常规检测。采用本发明建立的PCR方法检测了我国2017-2018年11个不同省份不同猪场的总共1402份田间样品，PCV3的阳性检出率为29.48％，具有一定临床应用价值，可用于临床PCV3的检测。
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