公开(公告)号：CN101101296A

公开(公告)日：2008-01-09

申请号：CN200710075255.4

申请日：2007-07-20

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 刘湘涛 ,  尹双辉 ,  尚佑军 ,  孙世琪 ,  刘艳红

IPC: G01N33/569 ,  G01N33/53

Abstract: 一种制备可用于检测猪圆环病毒2型抗体的Cap抗原的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(1)PCR克隆PCV2 ORF2的编码基因；(2)构建重组表达载体rCap；(3)在改良的LB液体培养基中，依次37℃诱导和低温长时间诱导rCap表达；(4)纯化rCap蛋白；其中所述改良的LB液体培养基包含6-9g/L蛋白胨、6-9g/L氯化钠以及2-4g/L酵母提取物；诱导rCap表达所使用的诱导剂为IPTG，其最终浓度为0.05-0.2mol/L；诱导rCap表达的第一诱导温度为37℃，第二诱导温度为16-20℃；诱导rCap表达的第一诱导时间为3-6小时，第二诱导时间为12-20小时。该方法促进了rCap在大肠杆菌中表达产生可溶性rCap蛋白，减少了包涵体的形成，避免了复杂的变性、复性过程，同时分离纯化所得可溶性rCap蛋白的生物学活性接近于PCV2病毒天然蛋白。

公开(公告)号：CN101418303B

公开(公告)日：2011-04-06

申请号：CN200810150304.0

申请日：2008-07-06

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 刘湘涛 ,  尹双辉 ,  孙世琪 ,  田宏 ,  尚佑军 ,  韩雪清 ,  刘艳红

IPC: C12N15/40 ,  C12N15/70 ,  C07K14/08 ,  A61K39/187 ,  A61P31/14

Abstract: 一种猪瘟重组亚单位疫苗的制备方法，包括下述步骤：A.利用逆转录-聚合酶链式反应方法克隆猪瘟疫苗株E2蛋白的编码基因；B.构建融合E2基因；C.构建重组表达载体rE2；D.rE2的诱导表达：E.rE2纯化。F.Western blotting方法检测rE2活性。本发明创造性地以双E2基因串联表达方式使E2抗原表位的数量增加一倍，显著提高了重组E2亚单位疫苗的免疫效果；为提高双E2蛋白表达效率，在第二个E2基因5′端起始密码子(ATG)上游增加一个大肠杆菌RBS序列(5`-AAGGAG-3`)；同时在串联的E2基因之间增加氨基酸接头5`-GSA GSAAGS GEF-3`，使获得的E2蛋白能够完整展示其抗原表位。本发明的E2蛋白重组亚单位疫苗，免疫保护效果与猪瘟兔化弱毒疫苗相当。

公开(公告)号：CN101418304A

公开(公告)日：2009-04-29

申请号：CN200810150305.5

申请日：2008-07-06

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 刘湘涛 ,  尹双辉 ,  孙世琪 ,  田宏 ,  尚佑军 ,  韩雪清 ,  刘艳红

IPC: C12N15/40 ,  C12N15/70 ,  C07K14/08 ,  G01N33/53

Abstract: 一种制备用于检测猪瘟病毒血清抗体的可溶性E2抗原的方法，包括下述步骤：A.克隆E2基因抗原结构域部分；B.构建重组表达载体；C.在LB培养基中表达，获得可溶性的重组E2蛋白；D.亲和层析纯化重组E2蛋白；E.pGST－E2表达蛋白的鉴定，SDS－PAGE和Western Blotting鉴定表达的重组E2蛋白；F.利用重组E2蛋白建立检测猪瘟血清抗体间接ELISA方法。本发明改良了传统的LB培养基，促进可溶性的E2蛋白表达；解决了猪瘟病毒E2抗原在大肠杆菌中主要以包涵体表达的难题，获得的可溶性E2蛋白与完整猪瘟病毒粒子具有相似的免疫学效果，可作为替代猪瘟病毒粒子的抗原，建立敏感性、特异、安全和可靠的猪瘟病毒血清抗体的检测间接ELISA方法。

公开(公告)号：CN104357444A

公开(公告)日：2015-02-18

申请号：CN201410539364.7

申请日：2014-10-13

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 刘艳红 ,  尚佑军 ,  孙德惠 ,  刘湘涛 ,  殷宏 ,  龚真莉 ,  祁淑芸 ,  李勇

IPC: C12N15/113 ,  C12N15/86 ,  C12N5/071

Abstract: 本发明提供了使牛trim5α基因沉默的干扰方法，siRNA序列，siRNA人慢病毒表达载体，复制缺陷型人慢病毒，人慢病毒感染的MDBK细胞。本发明的RNAi和siRNA慢病毒表达载体有效的干扰牛trim5α基因的表达，显著提高人慢病毒载体在牛肾传代细胞MDBK中的基因表达。本发明为牛病毒病相关基因功能和转基因牛培育的研究提供新的技术支持。

公开(公告)号：CN101418303A

公开(公告)日：2009-04-29

申请号：CN200810150304.0

申请日：2008-07-06

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 刘湘涛 ,  尹双辉 ,  孙世琪 ,  田宏 ,  尚佑军 ,  韩雪清 ,  刘艳红

IPC: C12N15/40 ,  C12N15/70 ,  C07K14/08 ,  A61K39/187 ,  A61P31/14

Abstract: 一种猪瘟重组亚单位疫苗的制备方法，包括下述步骤：A.利用逆转录－聚合酶链式反应方法克隆猪瘟疫苗株E2蛋白的编码基因；B.构建融合E2基因：C.构建重组表达载体rE2；D.rE2的诱导表达：E.rE2纯化。F.Western blotting方法检测rE2活性。本发明创造性地以双E2基因串联表达方式使E2抗原表位的数量增加一倍，显著提高了重组E2亚单位疫苗的免疫效果；为提高双E2蛋白表达效率，在第二个E2基因 5′端起始密码子(ATG)上游增加一个大肠杆菌RBS序列(5′－AAGGAG－3′)；同时在串联的E2基因之间增加氨基酸接头5′－GSA GSAAGS GEF－3′，使获得的E2蛋白能够完整展示其抗原表位。本发明的E2蛋白重组亚单位疫苗，免疫保护效果与猪瘟兔化弱毒疫苗相当。

公开(公告)号：CN101418304B

公开(公告)日：2011-08-31

申请号：CN200810150305.5

申请日：2008-07-06

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 刘湘涛 ,  尹双辉 ,  孙世琪 ,  田宏 ,  尚佑军 ,  韩雪清 ,  刘艳红

IPC: C12N15/40 ,  C12N15/70 ,  C07K14/08 ,  G01N33/53

Abstract: 一种制备用于检测猪瘟病毒血清抗体的可溶性E2抗原的方法，包括下述步骤：A.克隆E2基因抗原结构域部分；B.构建重组表达载体；C.在LB培养基中表达，获得可溶性的重组E2蛋白；D.亲和层析纯化重组E2蛋白；E.pGST-E2表达蛋白的鉴定，SDS-PAGE和Western Blotting鉴定表达的重组E2蛋白；F.利用重组E2蛋白建立检测猪瘟血清抗体间接ELISA方法。本发明改良了传统的LB培养基，促进可溶性的E2蛋白表达；解决了猪瘟病毒E2抗原在大肠杆菌中主要以包涵体表达的难题，获得的可溶性E2蛋白与完整猪瘟病毒粒子具有相似的免疫学效果，可作为替代猪瘟病毒粒子的抗原，建立敏感性、特异、安全和可靠的猪瘟病毒血清抗体的检测间接ELISA方法。

公开(公告)号：CN101130780A

公开(公告)日：2008-02-27

申请号：CN200710141553.9

申请日：2007-08-01

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 刘艳红 ,  刘湘涛 ,  刘俊林 ,  李炯 ,  安芳兰 ,  田宏 ,  尚佑军

IPC: C12N15/66 ,  C12N15/42 ,  C12N15/85 ,  C07K14/09 ,  A61K39/135

Abstract: 本发明涉及一种制备用于预防因A型口蹄疫病毒引起的动物疾病的亚单位疫苗，以及这种方法制备的疫苗。本发明疫苗的制备方法是：设计引物与模板并用聚合酶链式反应分别制备出口蹄疫病毒的P12X基因和3C基因，再将所得到的P12X基因和3C基因插入到逆转录病毒表达载体多克隆位点，构建重组逆转录病毒表达载体，再将重组逆转录病毒表达载体和含VSV－G基因的质粒载体通过脂质体共转染至包装细胞GP2－293，在包装细胞内形成假病毒，再将假病毒基因组中含有的P12X3C基因整合到幼仓鼠肾细胞的基因组中并表达结构蛋白和蛋白酶3C。