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公开(公告)号：CN111944847A
公开(公告)日：2020-11-17
申请号：CN202010889546.2
申请日：2020-08-28
Applicant: 西北农林科技大学
Abstract: 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一套等位基因高效替换系统及其建立方法。该系统依赖于一套双筛选表达盒，所述双筛选表达盒针对位于两条姐妹染色单体的等位基因，分别引入了两种不同的荧光蛋白、两种不同的抗性基因，并分别添加胸腺激酶负向筛选基因。利用该表达盒和对应的基因替换系统，我们提供了一种新的基于SSA修复机制的精确编辑思路，可以在实现高效基因组精确编辑的同时，有效避免传统基于Cre/LoxP重组酶系统的LoxP序列残留、转座子系统敲出的筛选基因序列在基因组“跳跃”造成的插入，以及同源重组修复系统二次HDR筛选效率低等问题，为基因组精确编辑提供了一条简洁高效的新思路。
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公开(公告)号：CN106011171B
公开(公告)日：2019-10-11
申请号：CN201610333062.3
申请日：2016-05-18
Applicant: 西北农林科技大学
IPC: C12N15/85
Abstract: 本发明主要属于基因编辑技术领域，具体涉及一种基因无缝编辑方法。该方法构建靶向CCR5和eGFP的CRISPR/Cas9表达载体CCR5.CRISPR/Cas9和eGFP.CRISPR/Cas9，并构建供体CCR5‑Donor载体；随后通过两次转染，利用CRISPR‑Cas9系统及细胞内的HR和SSA修复机制，通过细胞的嘌呤霉素和更昔洛韦正负向筛选，完成无缝编辑。
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公开(公告)号：CN105861552B
公开(公告)日：2019-10-11
申请号：CN201610261461.3
申请日：2016-04-25
Applicant: 西北农林科技大学
Abstract: 本发明主要属于高等生物体基因组编辑技术领域，具体涉及一种T7 RNA聚合酶介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统的构建方法。所述方法基于T7 RNA聚合酶和T7启动子的高度特异性识别原理，首先构建T7启动子‑sgRNA，将T7启动子‑sgRNA、Cas9表达质粒以及T7 RNA聚合酶表达质粒共同转入细胞，T7 RNA聚合酶催化T7启动子启动sgRNA的转录，从而引导Cas9在靶位点处，进行切割，完成基因编辑过程。本发明所述方法利用T7启动子表达sgRNA，简化了CRISPR/Cas9系统的设计步骤，使得更多的人能够快速简便使用CRISPR/Cas9这一基因编辑工具研究感兴趣的基因位点。
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公开(公告)号：CN110305888A
公开(公告)日：2019-10-08
申请号：CN201910574438.3
申请日：2019-06-28
Applicant: 西北农林科技大学
Abstract: 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种检测人工核酸酶诱导Indels突变检测系统的构建与应用。采取的具体技术方案为：提供一种ara-mFabI检测系统，包括3个检测载体，每个载体单独负责一种类型插入片段的定量与定性揭示。3个载体的区别在于：mFabI基因开放阅读框的类型不同；分别由mFabI基因扩增引物的上游引物分别引入9、10、11个碱基以改变mFabI基因的ORF。使用本发明提供的检测系统，能实现核酸酶诱导的各类型Indels突变频率的定量揭示；并能达到与扩增子测序相近的Indels突变频率与类型分布。
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公开(公告)号：CN109880851A
公开(公告)日：2019-06-14
申请号：CN201910244538.X
申请日：2019-03-28
Applicant: 西北农林科技大学
IPC: C12N15/85 , C12N15/113 , C12N15/65 , C12N15/90 , C12N5/10
Abstract: 本发明公开了一种用于富集CRISPR/Cas9介导的同源重组修复细胞的筛选报告载体及筛选方法。筛选报告载体包括通用sgRNA表达盒、Cas9表达盒、抗性基因表达盒以及抗性基因同源重组修复模板，筛选报告载体自身可以通过抗性基因序列同源重组修复而使细胞产生抗性。所述的筛选报告载体与用于细胞基因组HDR编辑的打靶载体及供体载体组成共转染系统，可应用于高效富集发生点编辑、片段插入和片段删除的HDR阳性细胞克隆，并且可广泛应用于哺乳动物的多种细胞，显著提高了HDR编辑细胞的筛选效率，同时无需对细胞基因组的无关位置再引入双链断裂与DNA整合，为推动精准基因编辑的研究和应用提供有效途径。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN106011171A
公开(公告)日：2016-10-12
申请号：CN201610333062.3
申请日：2016-05-18
Applicant: 西北农林科技大学
IPC: C12N15/85
Abstract: 本发明主要属于基因编辑技术领域，具体涉及一种利用CRISPR/Cas9技术基于SSA修复的基因无缝编辑方法。所述基因无缝编辑方法首先构建靶向CCR5和eGFP的CRISPR/Cas9表达载体CCR5. CRISPR/Cas9和eGFP.CRISPR/Cas9，并构建供体CCR5‑Donor载体，所述CCR5‑Donor质粒载体具有pXL‑BACII‑L‑arm‑CAG‑TK‑PGK‑PuroR‑T2A‑eGFP‑bGH pA ‑R‑arm结构，其中，L‑arm和R‑arm为左右同源臂，L‑arm和R‑arm中间的CAG‑TK‑PGK‑PuroR‑T2A‑eGFP‑bGH pA为筛选标记组件；通过两次转染，利用CRISPR‑Cas9系统及细胞内的HR和SSA修复机制，通过细胞的嘌呤霉素和更昔洛韦正负向筛选，完成无缝编辑。
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公开(公告)号：CN105255937A
公开(公告)日：2016-01-20
申请号：CN201510500937.X
申请日：2015-08-14
Applicant: 西北农林科技大学
Abstract: 本发明是利用一个真核细胞III型启动子（U6或H1）启动由Drosha切割位点串联的多个发卡结构小RNA的表达，在真核细胞内表达后可以产生多个有生物活性的CRISPR sgRNA，以U6-sgRNA-shRNA-sgRNA的结构为例，这种U6启动表达的结构在一次转录中产生含有多个sgRNA和shRNA的初级转录本，在真核细胞中这些sgRNA经过加工后可以分别识别各自的靶位点，从而指导Cas9蛋白打靶多个位点，为多基因编辑打下基础。相比于传统的分别表达多个单一gRNA的方法和植物上新近报道的tRNA-gRNA系统，本发明的结构更简单，构建更方便。此外，本发明还可以通过Golden Gate的方法继续串联shRNA-sgRNA的序列打靶更多的位点或者表达多个shRNA干扰基因的表达。
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公开(公告)号：CN103695327A
公开(公告)日：2014-04-02
申请号：CN201310647359.3
申请日：2013-12-02
Applicant: 西北农林科技大学
Abstract: 本发明公开了一种口服重组酵母及其介导的靶向肠道DC呈递shRNA的应用，以酵母菌株作为宿主细胞，宿主细胞中转染有shRNA干扰载体，该shRNA干扰载体上设有启动子-shRNA-miR30的元件排列。该口服重组酵母能够穿过活体生物的胃肠道环境，靶向肠道DC细胞传递shRNA新方法，该方法可以有效的解决现有技术中向DC呈递时存在的弊端，能够广泛应用于基因治疗。
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公开(公告)号：CN103305548A
公开(公告)日：2013-09-18
申请号：CN201310003808.0
申请日：2013-01-06
Applicant: 西北农林科技大学
Abstract: 本发明涉及一种由口服基因工程发酵酵母介导的小鼠肠道DC细胞表达外源基因和内源基因的方法及应用，属于免疫学和基因工程技术领域。所述基因工程发酵酵母含有真核基因表达载体JMB84-CMV-β-catenin-HA-T2A-GFP-polyA或JMB84-CMV-eGFP-polyA，真核基因表达载体可以整合在酵母基因组或者作为酵母质粒随酵母细胞进行复制。应用该基因工程酵母饲喂6周龄FVB小鼠，5天后分离FVB小鼠肠道DC细胞可检测到目的基因的表达；若饲喂JMB84-CMV-eGFP-polyA载体，口服免疫35天后，能够在小鼠血清中检测到特异性抗体的产生。本发明具有应用基因工程酵母作为功能基因运送载体，靶向调控哺乳动物肠道免疫细胞(树突状细胞)的功能，能够应用于治疗自身免疫疾病和新型口服疫苗开发和生产的优点。
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公开(公告)号：CN102174576A
公开(公告)日：2011-09-07
申请号：CN201110027367.9
申请日：2011-01-25
Applicant: 西北农林科技大学
IPC: C12N15/861 , C12N9/22 , C12N15/85 , A01K67/027
Abstract: 本发明一种由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法和该锌指核酸酶及其表达载体，属于基因工程技术领域。其中所述的方法包括：(1)内源基因靶位点的选择；(2)构建穿梭载体pAdTrack-CMV-T2A；(3)制备重组ZFN腺病毒载体pAd-T2A-ZFN；(4)腺病毒包装，得到ZFN腺病毒；(5)步骤(4)得到的ZFN腺病毒转染哺乳动物细胞。本发明利用ZFN技术，使动物哺乳细胞基因突变效率达到13％，大大提高了内源基因的定向敲除效率。
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