公开(公告)号：CN111826389B

公开(公告)日：2022-05-13

申请号：CN202010455589.X

申请日：2020-05-26

Applicant: 江南大学

Inventor： 陈献忠 ,  杨海泉 ,  王浩坤 ,  张坤杰 ,  王拂祥 ,  沈微 ,  夏媛媛

IPC: C12N15/70 ,  C12N15/57 ,  C12N1/21 ,  C12N9/04 ,  C12N9/08 ,  C12N9/10 ,  C12N9/16 ,  C12N9/26 ,  C12N9/48 ,  C07K14/78 ,  C07K14/435 ,  C12P21/02 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明涉及一种提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法，通过同源重组的方法将包含1‑4个SD序列的基因片段整合至编码D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸羧肽酶DacA的启动子与DacA编码基因之间。本发明通过整合不同的SD序列至大肠杆菌DacA基因的启动子与DacA编码基因之间，提高了D,D‑羧肽酶DacA的表达，从而提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平。

公开(公告)号：CN108410845B

公开(公告)日：2020-09-04

申请号：CN201810311758.5

申请日：2018-04-09

Applicant: 江南大学

Inventor： 许菲 ,  杨海泉 ,  陈媛 ,  卢潇 ,  王浩坤 ,  王拂祥 ,  代瑶

IPC: C12N9/48 ,  C12N15/57 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P13/06 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种催化效率提高的D,D‑羧肽酶DacA突变体及其制备方法，属于遗传工程和酶工程领域。本发明公开了由大肠杆菌(Escherichia coli)BL21来源的D,D‑羧肽酶DacA为母本，基于酶结构解析确定关键位点及突变方式，经分子生物学技术进行定点突变而获得催化效率提高的DacA突变体。在此改造条件下，E.coli D,D‑羧肽酶DacA的突变体K113G催化效率常数kcat值提高最多，由6543.4s‑1提高至9428.1s‑1。利用此策略可以显著提高D,D‑羧肽酶DacA的催化效率，为其在代谢改造E.coli提高其胞外分泌水平等方面的应用提供了基础。此策略对其它酶的性质改造具有重要的指导意义。

公开(公告)号：CN111826389A

公开(公告)日：2020-10-27

申请号：CN202010455589.X

申请日：2020-05-26

Applicant: 江南大学

Inventor： 陈献忠 ,  杨海泉 ,  王浩坤 ,  张坤杰 ,  王拂祥 ,  沈微 ,  夏媛媛

IPC: C12N15/70 ,  C12N15/57 ,  C12N1/21 ,  C12N9/04 ,  C12N9/08 ,  C12N9/10 ,  C12N9/16 ,  C12N9/26 ,  C12N9/48 ,  C07K14/78 ,  C07K14/435 ,  C12P21/02 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明涉及一种提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法，通过同源重组的方法将包含1-4个SD序列的基因片段整合至编码D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶DacA的启动子与DacA编码基因之间。本发明通过整合不同的SD序列至大肠杆菌DacA基因的启动子与DacA编码基因之间，提高了D,D-羧肽酶DacA的表达，从而提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平。

公开(公告)号：CN109234297A

公开(公告)日：2019-01-18

申请号：CN201811172964.9

申请日：2018-10-09

Applicant: 江南大学

Inventor： 陈献忠 ,  杨海泉 ,  沈微 ,  卢潇 ,  胡金远 ,  王拂祥 ,  王浩坤 ,  陈媛

IPC: C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12N9/26 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种提高大肠杆菌重组蛋白胞外分泌水平的方法，属于基因工程与发酵工程领域。本发明通过敲除D-丙氨酰-D-丙氨酸羧肽酶dacA和dacB基因(单敲除和双敲除)，获得重组蛋白胞外分泌水平显著提高的重组大肠杆菌突变株。采用绿色荧光蛋白(GFP)和淀粉酶为模式重组蛋白，证明了本发明方法可显著提高胞外蛋白的含量。单敲除和复合敲除dacA和dacB后，GFP胞外荧光值分别提高2.1、2.1和2.7倍；单敲除和复合敲除dacA和dacB后，淀粉酶胞外酶活力占总酶活力的比例分别由对照菌的40.7％提高至44.7％、62.1％和64.2％。本发明方法对重组蛋白在大肠杆菌中的高效分泌与生产具有重要指导意义。

公开(公告)号：CN108410845A

公开(公告)日：2018-08-17

申请号：CN201810311758.5

申请日：2018-04-09

Applicant: 江南大学

Inventor： 许菲 ,  杨海泉 ,  陈媛 ,  卢潇 ,  王浩坤 ,  王拂祥 ,  代瑶

IPC: C12N9/48 ,  C12N15/57 ,  C12N15/70 ,  C12N1/21 ,  C12P13/06 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种催化效率提高的D,D-羧肽酶DacA突变体及其制备方法，属于遗传工程和酶工程领域。本发明公开了由大肠杆菌(Escherichia coli)BL21来源的D,D-羧肽酶DacA为母本，基于酶结构解析确定关键位点及突变方式，经分子生物学技术进行定点突变而获得催化效率提高的DacA突变体。在此改造条件下，E.coli D,D-羧肽酶DacA的突变体K113G催化效率常数kcat值提高最多，由6543.4s-1提高至9428.1s-1。利用此策略可以显著提高D,D-羧肽酶DacA的催化效率，为其在代谢改造E.coli提高其胞外分泌水平等方面的应用提供了基础。此策略对其它酶的性质改造具有重要的指导意义。