公开(公告)号：CN106565829A

公开(公告)日：2017-04-19

申请号：CN201610937115.2

申请日：2016-11-01

Applicant: 扬州大学

Inventor： 叶建强 ,  刘敏 ,  姚晓慧 ,  季星妤 ,  韦芊含 ,  邵红霞 ,  秦爱建 ,  田晓彦 ,  万志敏

IPC: C07K14/01 ,  C12N15/70 ,  C12N15/11

CPC classification number: C07K14/005 ,  C12N15/70 ,  C12N2750/10022 ,  C12N2800/101

Abstract: 本发明还提供了一种GyV9环形病毒VP3蛋白制备方法，该方法基于重组酶ExnaseTM II将线性化的pGEX‑6p‑1载体与GyV9病毒VP3基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆技术；并转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达；其中，PCR扩增所述的GyV9病毒VP3基因片段时所用引物的核苷酸序列如下：上游引物1：5’‑GTTCCAGGGGCCCATGGATGCGACGGGCAC‑3’；下游引物1：5’‑GTTTTCACCGTCATTACAATCTTGCGCCTT‑3’。该方法简化克隆过程，可快速构建GyV9病毒VP3基因的原核表达载体，实现VP3基因快速克隆表达。本发明获得的GyV9病毒VP3表达及纯化的蛋白，可直接提供VP3蛋白作为GyV9诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体；为开展GyV9流行病学调查提供有效诊断试剂；并为进一步探究VP3生物学功能具有重要意义。

公开(公告)号：CN105779649A

公开(公告)日：2016-07-20

申请号：CN201610186635.4

申请日：2016-03-29

Applicant: 扬州大学 ,  国药集团扬州威克生物工程有限公司

Inventor： 叶建强 ,  谢泉 ,  张建军 ,  邵红霞 ,  秦爱建 ,  钱琨 ,  高巍 ,  万志敏

IPC: C12Q1/70 ,  C12Q1/68 ,  C12R1/93

CPC classification number: C12Q1/702 ,  C12Q1/6804 ,  C12Q2531/113 ,  C12Q2563/107 ,  C12Q2545/113

Abstract: 本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种检测禽白血病病毒的免疫PCR试剂盒。所述试剂盒包括：两个抗体寡核苷酸探针、连接反应液、DNA连接酶、蛋白酶、Fast Master混合液和Universal qPCR反应液。本发明利用生物素标记的抗禽白血病病毒特异性抗体以及商品化邻位连接试剂，通过免疫PCR检测样品中禽白血病病毒抗原。实现不用对样品进行繁琐的核酸提取过程，通过PCR方法对禽白血病病毒抗原进行快速高通量检测。这一检测禽白血病病毒免疫PCR试剂盒将应用于禽白血病病毒临床检测与净化中，将填补国内外相关技术空白。

公开(公告)号：CN119019516A

公开(公告)日：2024-11-26

申请号：CN202411439106.1

申请日：2024-10-15

Applicant: 扬州大学

Inventor： 叶建强 ,  马丽华 ,  李拓凡 ,  万志敏 ,  谢泉 ,  王伟康 ,  王胜男 ,  邵红霞 ,  秦爱建

IPC: C07K14/165 ,  C12N15/50 ,  C12N15/70 ,  G01N33/569 ,  G01N33/543

Abstract: 本发明公开了一种用于鸡传染性支气管炎病毒抗体检测试剂盒的抗原及其间接ELISA检测试剂盒和应用，所述抗原为经过纯化的鸡传染性支气管炎病毒核蛋白的重组N蛋白，所述重组蛋白的编码基因如SEQ ID NO.1所示；所述间接ELISA检测试剂盒含有经过纯化的鸡传染性支气管炎病毒重组N蛋白的酶标板。本发明建立的检测传染性支气管炎病毒抗体的ELISA试剂盒与进口的IDEXX试剂盒符合率为91.3％。本试剂盒具有成本低廉、使用简单方便、敏感性高且特异性强的优点，且与不同血清型的IBV均有良好的反应性，具有一定的市场应用前景与价值。

公开(公告)号：CN118638783A

公开(公告)日：2024-09-13

申请号：CN202410709230.9

申请日：2024-06-03

Applicant: 扬州大学

Inventor： 朱承欢 ,  王伟康 ,  孟婷 ,  叶建强 ,  谢泉 ,  王圆梦 ,  万志敏 ,  李拓凡 ,  秦爱建

IPC: C12N15/113 ,  C12N5/10 ,  C12N15/12 ,  C12N9/22 ,  C12N15/85 ,  C12N7/00 ,  C12R1/91

Abstract: 本发明公开了一种敲除14‑3‑3ε基因的LMH细胞系及其构建方法和应用，包括如下步骤：设计特异性靶向鸡源14‑3‑3ε基因的sgRNA；构建含有Cas9蛋白基因和特异性靶向鸡源14‑3‑3ε基因的sgRNA的敲除质粒；将构建的敲除质粒对LMH细胞进行转染，筛选培养后获得14‑3‑3ε基因敲除的LMH细胞系。本发明通过CRISPR/Cas9基因编辑，成功获得鸡源14‑3‑3ε基因敲除LMH细胞系，发现该细胞系能够有效促进血清4型禽腺病毒的感染复制，该细胞系生长活性与正常LMH细胞无明显差异。本发明为探究鸡源14‑3‑3ε生物学功能以及解析14‑3‑3ε在FAdV‑4的感染复制中的作用打下了基础。

公开(公告)号：CN116474085A

公开(公告)日：2023-07-25

申请号：CN202310490815.1

申请日：2023-05-04

Applicant: 扬州大学

Inventor： 叶建强 ,  路浩 ,  张建军 ,  王伟康 ,  张伟 ,  谢泉 ,  连明君 ,  万志敏 ,  李拓凡 ,  周玉双

IPC: A61K39/235 ,  C12N15/861 ,  C12N15/34 ,  C12N7/01 ,  A61K39/295 ,  A61P31/20 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明涉及一种重组禽腺病毒二价灭活疫苗，疫苗是灭活的表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒FA4‑F。表达血清8b型禽腺病毒纤突蛋白的重组血清4型禽腺病毒FA4‑F的构建方法，在表达EGFP的重组血清4禽腺病毒的F1和F2基因之间插入血清8b型禽腺病毒纤突基因。一种重组禽腺病毒二价灭活疫苗，灭活是将细胞培养的FA4‑F的重组病毒液加入0.1％v/v的甲醛37℃作用24h进行灭活；甲醛灭活病毒液与油佐剂按1:3(v/v)的比例乳化用于制备油佐剂灭活疫苗。通过本发明，针对目前国内鸡群中正流行爆发的由FAdV‑4和FAdV‑8感染引起的HHS和IBH，为防控FAdV‑4和FAdV‑8b的感染提供了候选疫苗株；因此，本发明具有一定的市场应用价值。

公开(公告)号：CN116376979A

公开(公告)日：2023-07-04

申请号：CN202310353553.4

申请日：2023-04-04

Applicant: 扬州大学

Inventor： 叶建强 ,  路浩 ,  连明君 ,  谢泉 ,  高巍 ,  王伟康 ,  万志敏 ,  邵红霞 ,  秦爱建

IPC: C12N15/85 ,  C12N15/113 ,  C12N15/12 ,  C12N5/10

Abstract: 本发明涉及一种基于CRISPR‑Cas9编辑技术的敲除鸡柯萨奇腺病毒受体CAR基因的细胞系的构建方法，包括以下步骤：步骤1)、设计一种特异性靶向鸡CAR基因的sgRNA；步骤2)、构建一种用于靶向敲除鸡CAR基因的CRISPR‑Cas9系统，CRISPR‑Cas9系统中含有Cas9蛋白和上述特异性靶向鸡CAR基因的sgRNA，或者含有携带编码Cas9蛋白的编码序列和编码sgRNA的编码序列；CRISPR‑Cas9系统中，Cas9蛋白基因和sgRNA序列位于同一载体上，所述载体为lentiCRISPR v2；步骤3)、将lentiCRISPR v2质粒转染到细胞中，利用CRISPR‑Cas9系统编辑实现CAR基因沉默，通过药物筛选杀死阴性细胞，随后通过亚克隆的方法获得单克隆细胞株，从而获得鸡源CAR敲除的细胞系。本发明为探究CAR生物学功能与解析CAR基因在FAdV‑8b的感染中的作用打下了基础，具有较大的应用研究价值。

公开(公告)号：CN116286685A

公开(公告)日：2023-06-23

申请号：CN202310186696.0

申请日：2023-03-01

Applicant: 扬州大学

Inventor： 郭艺文 ,  叶建强 ,  谢泉 ,  袁雅琴 ,  秦爱建 ,  邵红霞 ,  万志敏 ,  李拓凡

IPC: C12N7/01 ,  C12N15/44 ,  C12N15/34 ,  C12N15/113 ,  C12N15/861 ,  C12N15/65 ,  C12R1/93

Abstract: 本发明涉及一种基于CRISPR‑Cas9技术的表达H9N2禽流感病毒XZ491毒株HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其制备方法，利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体插入H9N2禽流感病毒HA基因，成功获得H9N2禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒，为同时免疫防控血清4型禽腺病毒和H9亚型禽流感病毒提供技术支撑和疫苗候选。与传统的重组禽腺病毒构建方法不同，本发明中靶向毒力基因fiber‑2，使用了双荧光体系，且整合了CRISPR/Cas9技术和Cre‑loxP重组系统，不需要对禽腺病毒全基因组进行克隆，使得重组禽腺病毒的构建、筛选及其纯化非常快捷及高效。

公开(公告)号：CN115980344A

公开(公告)日：2023-04-18

申请号：CN202210805714.4

申请日：2022-07-08

Applicant: 扬州大学

Inventor： 叶建强 ,  张辛耘 ,  高巍 ,  任丹 ,  秦爱建 ,  万志敏 ,  李拓凡 ,  谢泉 ,  邵红霞

IPC: G01N33/569 ,  G01N33/58 ,  C07K14/08 ,  C12N15/866 ,  C12N15/40 ,  C07K1/22

Abstract: 本发明涉及一种基于昆虫细胞表达产物的检测新型鹅星状病毒抗体的ELISA试剂盒，本发明的原理是将表达新型GAstV的ORF2重组蛋白的杆状病毒感染Sf9细胞，并以镍柱亲和层析法纯化感染细胞裂解液上清中的ORF2重组蛋白，将纯化的重组蛋白分别作为包被抗原组装检测新型GAstV抗体的间接ELISA试剂盒。研究结果表明，建立的检测新型GAstV抗体的间接ELISA试剂盒具有良好的特异性和灵敏性，在新型GAstV病毒流行病学调查中具有良好的应用价值。

公开(公告)号：CN114457115A

公开(公告)日：2022-05-10

申请号：CN202210220996.1

申请日：2022-03-08

Applicant: 扬州大学

Inventor： 高巍 ,  张辛耘 ,  叶建强 ,  任丹 ,  秦爱建 ,  万志敏 ,  李拓凡 ,  谢泉 ,  邵红霞

IPC: C12N15/866 ,  C12N15/40 ,  C12N7/01

Abstract: 本发明涉及一种表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒的构建方法，包括以下步骤：（1）构建GAstV‑ORF2基因重组杆状病毒表达载体：（2）表达重组GAstV‑ORF2蛋白的杆状病毒包装和传代：（3）将携带有GAstV‑ORF2基因的杆状病毒质粒转染进Sf9细胞，并在27℃无CO2培养箱中培养5‑7天，每天观察细胞病变情况；当细胞病变达到70%时收集细胞上清，放入‑80℃保存；进行病毒的传代，传至第3代时，作为种毒保存并扩大培养，得到表达新型鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2的重组杆状病毒。本发明的原理是通过扩增鹅星状病毒衣壳蛋白ORF2全长片段，构建杆状病毒重组载体，转染Sf9细胞，获得能够表达衣壳蛋白ORF2的杆状病毒。

公开(公告)号：CN111534547A

公开(公告)日：2020-08-14

申请号：CN202010426111.4

申请日：2020-05-19

Applicant: 扬州大学

Inventor： 叶建强 ,  隆玉兰 ,  秦爱建 ,  张伟 ,  王伟康 ,  谢泉 ,  张建军 ,  李拓凡 ,  万志敏 ,  邵红霞

IPC: C12N15/866 ,  C12N15/70

Abstract: 本发明涉及一种表达血清4型禽腺病毒纤突蛋白F2的重组杆状病毒的构建方法，包括以下步骤：（1）构建FAdV-4-F2基因重组杆状病毒表达载体；（2）表达重组FAdV-4蛋白的杆状病毒包装和传代；（3）将携带有FAdV-4-F2基因的杆状病毒基因组转染进sf9细胞，27℃培养箱中培养5-7天，观察细胞病变情况；当细胞病变达到70%时收集细胞裂解液，离心去沉淀，作为种毒保存；进行病毒的传代，传至第3代时，作为种毒扩大培养。本发明利用杆状病毒表达系统构建了含F2基因的重组杆状病毒穿梭载体，将其转染Sf9细胞后获得重组杆状病毒rBA-F2，通过间接免疫荧光试验(IFA)和Western blot鉴定重组蛋白F2的表达。