本发明公开了一种产N‑乙酰神经氨酸的重组大肠杆菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明通过敲除6‑磷酸果糖激酶、甘油激酶引入甘油激酶突变体、用葡萄糖促进扩散转运蛋白替换PTS磷酸转移酶I并进行启动子优化，使重组大肠杆菌可以葡萄糖和甘油双碳源生长、合成N‑乙酰神经氨酸同时乙酸生成量极低。在此基础上，本发明又敲除了6‑磷酸果糖激酶编码基因pfkB，引入来自运动假单胞杆菌的异源ED途径，并通过拷贝数优化和RBS强度优化，使孔板水平下的产量进一步提升达到9.44g/L。