公开(公告)号：CN113005145B

公开(公告)日：2022-10-14

申请号：CN202110255931.6

申请日：2021-03-09

Applicant: 同济大学

Inventor： 张勇 ,  刘桂芬 ,  王湘秀 ,  王文

IPC: C12N15/85 ,  C12N15/62 ,  C12N9/22 ,  C07K19/00 ,  C12N15/10 ,  C12Q1/6806

Abstract: 本发明属于基因转录调控领域，具体涉及一种不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法。该方法包括以下步骤：S1、构建带有rFC标签的目的转录因子表达质粒，进而向细胞中引入TF‑rFC融合蛋白表达，培养到所需时期后收集细胞，并用磁珠偶联细胞；S2、通透磁珠偶联的细胞，加入pA(G)‑MNase融合蛋白孵育过夜；S3、通过加入CaCl2，活化MNase，终止反应并收集释放出核的TF‑染色质复合物，进行纯化；S4、将上述纯化后的DNA片段进行测序文库构建并进行高通量测序。本发明规避了传统用于富集TF在基因组上结合位点的方法中高质量特异性抗体的需要，且避免了由于抗体效率影响特异性结合位点的富集，进而可以使用少至5000个细胞在全基因组水平上捕获TF的结合位点。

公开(公告)号：CN113005145A

公开(公告)日：2021-06-22

申请号：CN202110255931.6

申请日：2021-03-09

Applicant: 同济大学

Inventor： 张勇 ,  刘桂芬 ,  王湘秀 ,  王文

IPC: C12N15/85 ,  C12N15/62 ,  C12N9/22 ,  C07K19/00 ,  C12N15/10 ,  C12Q1/6806

Abstract: 本发明属于基因转录调控领域，具体涉及一种不依赖于特异性抗体的捕获TF在全基因组上结合位点的方法。该方法包括以下步骤：S1、构建带有rFC标签的目的转录因子表达质粒，进而向细胞中引入TF‑rFC融合蛋白表达，培养到所需时期后收集细胞，并用磁珠偶联细胞；S2、通透磁珠偶联的细胞，加入pA(G)‑MNase融合蛋白孵育过夜；S3、通过加入CaCl2，活化MNase，终止反应并收集释放出核的TF‑染色质复合物，进行纯化；S4、将上述纯化后的DNA片段进行测序文库构建并进行高通量测序。本发明规避了传统用于富集TF在基因组上结合位点的方法中高质量特异性抗体的需要，且避免了由于抗体效率影响特异性结合位点的富集，进而可以使用少至5000个细胞在全基因组水平上捕获TF的结合位点。

公开(公告)号：CN105463090A

公开(公告)日：2016-04-06

申请号：CN201510967007.5

申请日：2015-12-21

Applicant: 同济大学

Inventor： 刘桂芬 ,  张勇 ,  陈韵如 ,  胡圣恩 ,  曾诗扬 ,  陈晓兰

IPC: C12Q1/68 ,  C12N15/10

CPC classification number: C12Q1/6888 ,  C12N15/1003 ,  C12N2330/31 ,  C12Q1/6869

Abstract: 本发明涉及应用于斑马鱼胚胎的先加标签的染色质免疫共沉淀高通量测序(iChIP-seq)实验方法，首先斑马鱼胚胎样本进行甲醛交联，然后通过MNase酶切获取单核小体，H3抗体将染色质固定在磁珠上，从而在磁珠上对各种不同的样品加上不同的标签接头，再将染色质从磁珠上释放出来浓缩后将样品混合在一起进行各种抗体的染色质免疫共沉淀反应，获得DNA样品纯化后建库测序。本发明iChIP是在传统的ChiP上进行的改良，这种方法是通过在染色质免疫共沉淀前先将每个样本进行标记后再将所有样品混合在一起进行实验，能观察到在发育过程中染色质修饰的一个动态变化，减少早期细胞量少可能造成的实验偏差，且可以通过细胞数数量对整个发育过程中的染色质修饰动态变化进行定量观察。

公开(公告)号：CN105463089A

公开(公告)日：2016-04-06

申请号：CN201510966989.6

申请日：2015-12-21

Applicant: 同济大学

Inventor： 刘桂芬 ,  张勇 ,  王璐莹 ,  霍霄 ,  赵程辰 ,  王文

IPC: C12Q1/68 ,  C12N15/10

CPC classification number: C12Q1/6888 ,  C12N15/1003 ,  C12N2330/31 ,  C12Q1/6869

Abstract: 本发明涉及一种应用于斑马鱼胚胎的易接近转座酶核染色质高通量测序实验(ATAC-seq)的方法，首先进行斑马鱼胚胎样本前处理，然后在胚胎中加入裂解缓冲液，用广口枪头在冰浴中裂解胚胎，立即进行转座反应并纯化DNA，然后通过实时荧光定量的方法确定建库用的循环数，直接通过一步PCR的方法进行建库测序。ATAC-seq和DNase-seq两种方法都能够对基因组染色质上调控序列进行定位和解读，但ATAC-seq步骤更为简单，需要的细胞也更少，在无法获得大量细胞的情况下，ATAC-seq更有帮助，且根据实验结果ATAC-seq获得的数据富集程度更高。本发明还将其应用到斑马鱼胚胎细胞中，对于研究生物体早期发育过程中的染色质结构的变化及相应的基因表达调控研究提供一种有效且简单的方法。

公开(公告)号：CN105441548A

公开(公告)日：2016-03-30

申请号：CN201510970471.X

申请日：2015-12-21

Applicant: 同济大学

Inventor： 刘桂芬 ,  张勇 ,  王湘秀 ,  陈玉洁 ,  王晨飞 ,  修文超

IPC: C12Q1/68

CPC classification number: C12Q1/6806 ,  C12Q1/6869 ,  C12Q2521/301 ,  C12Q2521/537 ,  C12Q2535/122

Abstract: 本发明涉及斑马鱼胚胎单细胞染色质超敏位点高通量测序实验方法，首先进行斑马鱼胚胎样本前处理，然后将胚胎转至含有裂解缓冲液的管中，用广口枪头在冰浴中裂解胚胎；再进行脱氧核糖核酸酶I酶切反应，抽提纯化DNA，利用建库试剂盒构建文库后通过琼脂糖胶电泳分离选择所需文库大小进行高通量测序及生物信息分析。与现有技术相比，本发明主要通过在沉淀过程中加入环状载体DNA来富集DNA量，从而能在单个细胞水平进行的DNase I超敏位点高通量测序技术，此方法能观察到细胞与细胞之间的转录调控区域的差异，剖析细胞的异质性，能更好的观察胚胎发育过程中基因转录调控的变化及机制研究。