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公开(公告)号：CN105671070B
公开(公告)日：2019-03-19
申请号：CN201610122595.7
申请日：2016-03-03
Applicant: 江南大学 , 江南大学(如皋)食品生物技术研究所
Abstract: 本发明公开了一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明构建敲除质粒PHY300dsrf，该质粒包含特异性靶向目的基因的sgRNA、cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的复制原点及抗性筛选标记。本发明所设计的特异性靶向srfA‑C基因的sgRNA，可以指引cas9蛋白在srfA‑C基因的特异性位点切割双链，然后再同源修复臂的指导下对基因组进行精确地同源性重组，在断裂处引入XhoI酶切位点。在对srfA‑C基因敲除成功的枯草芽孢杆菌进行上罐发酵培养，泡沫显著减少，证明该CRISPR/Cas9基因编辑系统可以有效的对枯草芽孢杆菌基因组进行基因编辑。
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公开(公告)号：CN105671070A
公开(公告)日：2016-06-15
申请号：CN201610122595.7
申请日：2016-03-03
Applicant: 江南大学 , 江南大学(如皋)食品生物技术研究所
CPC classification number: C12N15/75 , C07K14/32 , C12N2800/80 , C12N2999/007
Abstract: 本发明公开了一种用于枯草芽孢杆菌基因组编辑的CRISPRCas9系统及其构建方法，属于基因工程技术领域。本发明构建敲除质粒PHY300dsrf，该质粒包含特异性靶向目的基因的sgRNA、cas9基因、同源修复臂、大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的复制原点及抗性筛选标记。本发明所设计的特异性靶向srfA-C基因的sgRNA，可以指引cas9蛋白在srfA-C基因的特异性位点切割双链，然后再同源修复臂的指导下对基因组进行精确地同源性重组，在断裂处引入XhoI酶切位点。在对srfA-C基因敲除成功的枯草芽孢杆菌进行上罐发酵培养，泡沫显著减少，证明该CRISPR/Cas9基因编辑系统可以有效的对枯草芽孢杆菌基因组进行基因编辑。
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公开(公告)号：CN119955837A
公开(公告)日：2025-05-09
申请号：CN202510098394.7
申请日：2025-01-22
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了一种基因组整合型枯草芽孢杆菌的构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明利用Cre/lox基因编辑系统将麦芽糖淀粉酶amyM基因依次整合到枯草芽孢杆菌WS9C基因组的7个不同位点，构建了枯草芽孢杆菌WS9C7。以枯草芽孢杆菌WS9C7为表达宿主，过表达群体感应调节因子ComA，构建了枯草芽孢杆菌WS9C7C。在无抗生素添加的条件下，构建的基因工程菌摇瓶发酵60h时AmyM酶活可达到652U/mL～848U/mL，在3‑L罐发酵AmyM酶活可达6988U/mL～10847U/mL，具有良好的工业化应用潜力。
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公开(公告)号：CN118726439B
公开(公告)日：2025-04-15
申请号：CN202410765928.2
申请日：2024-06-14
Applicant: 江南大学
IPC: C12N15/75 , C12N1/21 , C12N15/67 , C12N9/26 , C12N9/38 , C12N9/42 , C12N15/31 , C12N15/54 , C12N15/55 , C12R1/125
Abstract: 本发明公开了一种构建重组蛋白表达能力提升的枯草芽孢杆菌底盘菌株的方法，属于酶程和微生物改造技术领域。本发明通过调控基因rodZ、lytS、hrcA、ypmS、ftsZ中的一个或多个基因，使枯草芽孢杆菌在摇瓶发酵生产的中温淀粉酶AmyS、β‑半乳糖苷酶、超高温淀粉酶、几丁质酶的表达量提高4.32倍、2.05倍、1.54倍、1.12倍。结合共表达PonA和发酵优化，在3‑L生物反应器高密度发酵中将AmyS的酶活提高至102,893U·mL‑1，是目前AmyS表达的最高水平。
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公开(公告)号：CN117821485A
公开(公告)日：2024-04-05
申请号：CN202311794936.1
申请日：2023-12-25
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了一种通过共表达增强因子提高α‑淀粉酶表达量的方法，属于酶工程和微生物改造技术领域。本发明将α淀粉酶基因与芽孢杆菌来源的增强因子共表达，可使摇瓶水平α淀粉酶的表达量提高1.58倍。本发明还通过优化共表达策略，通过整合枯草芽孢杆菌内源ponA和过表达ltaS使得α淀粉酶的表达量提高了2.09倍，最终α‑淀粉酶的酶活达到2901.6U/mL。本发明为提高外源蛋白在枯草芽孢杆菌表达水平提供了更多可选择位点，对提高外源外源蛋白表达量有重要的指导意义。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN114774343B
公开(公告)日：2023-09-12
申请号：CN202210571832.3
申请日：2022-05-24
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了一种生产2’‑岩藻糖基乳糖的大肠杆菌工程菌株及应用，属于合成生物学、微生物代谢工程技术和发酵工程技术等领域。本发明提供的2’‑岩藻糖基乳糖从头合成途径关键酶表达水平的调控策略，通过CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除大肠杆菌中与底物降解以及中间产物分流相关的一系列基因，同时将不同的酶分别进行基因组过表达或者质粒过表达的调控，能够大幅提高代谢通路的效率，利用相关策略构建的基因工程菌株使得到的大肠杆菌工程菌株在3‑L发酵罐条件下以甘油为碳源，乳糖为底物发酵95h可生产57.7g/L的2′‑FL，对于工业化生产2′‑FL具有重要意义。
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公开(公告)号：CN116656588A
公开(公告)日：2023-08-29
申请号：CN202310581833.0
申请日：2023-05-23
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了一种共表达芽孢杆菌来源增强因子提高重组蛋白在枯草芽孢杆菌中表达量的方法，属于酶程技术领域。本发明将编码重组蛋白基因分别与芽孢杆菌来源的PonA、PonA截短体、OppA或SppA共表达，以提高重组蛋白的表达量。结果显示，本发明的方法可使超高温淀粉酶、中温淀粉酶或蔗糖异构酶在摇瓶水平的表达量提高至3.96倍、1.49倍和2.26倍。在3L生物反应器高密度发酵中可将超高温淀粉酶的表达量提高26％。本发明枯草芽孢杆菌作为外源蛋白表达宿主提供了新的可开发靶点，同时为增强因子的优化改造提供了技术支持。
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公开(公告)号：CN114107146B
公开(公告)日：2023-08-25
申请号：CN202111306449.7
申请日：2021-11-05
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了一种无抗性标记营养缺陷型枯草芽孢杆菌的构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除了枯草芽孢杆菌WS9的丙氨酸消旋酶基因dal，构建了D‑丙氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌WS9DAL。以枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌WS9DAL为表达宿主，构建了三株表达麦芽糖淀粉酶的基因工程菌WS9DAL1，WS9DAL2和WS9DAL3。在无抗生素添加的条件下，对三株基因工程菌进行摇瓶发酵培养，发酵培养60h时MAase酶活分别达到714U/mL，519U/mL和892U/mL。
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公开(公告)号：CN112553134B
公开(公告)日：2022-09-06
申请号：CN202011601201.9
申请日：2020-12-30
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了本发明涉及一种在枯草芽孢杆菌中表达α‑淀粉酶的方法，属于基因工程以及生物工程技术领域。本发明通过敲除枯草芽孢杆菌WS9基因组上的hrcA基因，获得了枯草芽孢杆菌基因工程WHS9；通过优化Sec分泌系统元件，发现共表达编码Sec分泌系统中膜转运通道的主要成分SecYEG的基因最有利于α‑淀粉酶在枯草芽孢杆菌WHS9中的重组表达；通过筛选到的信号肽平衡了α‑淀粉酶在枯草芽孢杆菌WHS9中的整个分泌过程，最终获得的枯草芽孢杆菌重组菌WHS9GSAB经摇瓶培养后胞外α‑淀粉酶活性为2835.1U/mL，经3‑L罐发酵培养后胞外α‑淀粉酶活性可高达35779.5U/mL。
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公开(公告)号：CN114107146A
公开(公告)日：2022-03-01
申请号：CN202111306449.7
申请日：2021-11-05
Applicant: 江南大学
Abstract: 本发明公开了一种无抗性标记营养缺陷型枯草芽孢杆菌的构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑系统敲除了枯草芽孢杆菌WS9的丙氨酸消旋酶基因dal，构建了D‑丙氨酸营养缺陷型枯草芽孢杆菌WS9DAL。以枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌WS9DAL为表达宿主，构建了三株表达麦芽糖淀粉酶的基因工程菌WS9DAL1，WS9DAL2和WS9DAL3。在无抗生素添加的条件下，对三株基因工程菌进行摇瓶发酵培养，发酵培养60h时MAase酶活分别达到714U/mL，519U/mL和892U/mL。
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