公开(公告)号：CN114438225B

公开(公告)日：2023-01-24

申请号：CN202210142781.2

申请日：2022-02-16

Applicant: 西北农林科技大学

Inventor： 王小龙 ,  吴玉江 ,  李超 ,  陈炳春 ,  蔡蓓

IPC: C12Q1/6888 ,  C12N15/11 ,  C12Q1/6858

Abstract: 本发明属于遗传生物学技术领域，具体涉及一种与山羊低氧适应相关的结构变异分子标记及应用。所述结构变异分子标记位于山羊第26号染色体第42098934位碱基处的245bp插入/缺失，具体为如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第98bp处的插入缺失，插入/缺失的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还提供了用于检测该结构变异分子标记的特异性引物对和检测方法，所述特异性引物对的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。本发明所述结构变异分子标记不受山羊年龄、性别等因素的限制，可用于山羊高原低氧适应性引种和品种选育。

公开(公告)号：CN106957857A

公开(公告)日：2017-07-18

申请号：CN201610854586.7

申请日：2016-09-23

Applicant: 西北农林科技大学

Inventor： 王小龙 ,  陈玉林 ,  蔡蓓 ,  牛怡源 ,  马宝华

IPC: C12N15/85 ,  A01K67/027

CPC classification number: C12N15/85 ,  A01K67/0276 ,  A01K2217/075 ,  A01K2227/102 ,  C07K14/495 ,  C07K14/50 ,  C12N2800/106 ,  C12N2800/80 ,  C12N2810/10

Abstract: 本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9系统共同敲除山羊MSTN和FGF5基因的方法。本发明首先获得针对山羊MSTN第二外显子和第三外显子的sgRNA识别区的两段DNA序列，及针对山羊FGF5第一外显子的sgRNA识别区的两段DNA序列，分别设计并合成相应的sgRNA寡核苷酸序列；接着分别构建针对MSTN第二外显子和第三外显子、FGF5第一外显子且含T7启动子的体外转录载体；利用Cas9和sgRNA的体外转录载体获得Cas9 mRNA和sgRNA，可用于生产MSTN和FGF5共同敲除的转基因山羊。

公开(公告)号：CN106957858A

公开(公告)日：2017-07-18

申请号：CN201610854587.1

申请日：2016-09-23

Applicant: 西北农林科技大学

Inventor： 陈玉林 ,  王小龙 ,  蔡蓓 ,  牛怡源 ,  马宝华

IPC: C12N15/85 ,  A01K67/027

CPC classification number: C12N15/85 ,  A01K67/0276 ,  A01K2217/075 ,  A01K2227/103 ,  C12N2800/106 ,  C12N2800/80

Abstract: 本发明提供了一种利用CRISPR/Cas9系统共同敲除绵羊MSTN、ASIP、BCO2基因的方法。本发明首先获得针对绵羊MSTN第二外显子和第三外显子的sgRNA识别区的两段DNA序列、针对绵羊ASIP第五外显子的sgRNA识别区的两段DNA序列、针对绵羊BCO2第二外显子的sgRNA识别区的两段DNA序列，分别设计并和成相应的sgRNA寡核苷酸序列；接着分别构建针对绵羊MSTN第二外显子和第三外显子、针对绵羊ASIP第五外显子、针对绵羊BCO2第二外显子，且含T7启动子的saRNA体外转录载体；利用Cas9和sgRNA的体外转录载体通过体外转录获得Cas9 mRNA和sgRNA，通过受精卵注射可用于生产MSTN、ASIP、BCO2共同敲除的转基因绵羊。

公开(公告)号：CN106636212A

公开(公告)日：2017-05-10

申请号：CN201611005082.4

申请日：2016-11-15

Applicant: 西北农林科技大学

Inventor： 陈玉林 ,  王小龙 ,  牛怡源 ,  蔡蓓 ,  周世卫

IPC: C12N15/877 ,  A01K67/027

CPC classification number: C12N15/8772 ,  A01K67/0276 ,  A01K2217/075 ,  A01K2227/102 ,  A01K2267/02 ,  C07K14/47 ,  C12N2800/80

Abstract: 本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9系统生产GDF9基因编辑山羊的方法。本发明首先获得针对山羊GDF9第二外显子的sgRNA识别区的DNA序列；其次设计靶向DNA序列的sgRNA，构建针对GDF9第二外显子且含T7启动子的sgRNA体外转录载体；最后设计合成ssODN，利用Cas9和sgRNA的体外转录载体获得Cas9 mRNA、sgRNA，通过受精卵注射体外转录载体获得的Cas9 mRNA、sgRNA和合成的ssODN，即可用于生产GDF9基因PV397I点突变的基因编辑山羊。

公开(公告)号：CN114262708B

公开(公告)日：2024-07-02

申请号：CN202111586529.2

申请日：2021-12-21

Applicant: 西北农林科技大学

Inventor： 王小龙 ,  周世卫 ,  陈玉林 ,  高亚伟 ,  王倩 ,  蔡蓓

IPC: C12N15/12 ,  C12N15/10 ,  C12N15/63 ,  C12N15/66 ,  C12N15/89 ,  C12N15/113 ,  C12N5/10 ,  C12Q1/6888 ,  C12N15/11

Abstract: 本发明公开了一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒及其方法。所述的试剂盒中含有FecB‑pegRNA的体外转录模板质粒、FecB‑sgRNA的体外转录模板质粒以及PE2mRNA的体外转录模板质粒，以FecB‑pegRNA的体外转录模板质粒、FecB‑sgRNA的体外转录模板质粒为模板经PCR扩增得到的FecB‑pegRNA体外转录模板序列如SEQ ID No.4所示，FecB‑sgRNA体外转录模板序列如SEQ ID No.5所示。将体外转录获得的pegRNA、sgRNA及PE2mRNA纯化后混合，注射入绵羊受精卵细胞质中，受精卵体外培养后移植入同种雌性绵羊输卵管中，生产的后代经检测后获得FecB基因g.A746G定点突变绵羊。本发明模拟自然界中存在的FecB基因g.A746G绵羊，同时与传统CRISPR/Cas技术相比极大地避免了随机突变、bystander突变、脱靶突变及基因组损伤，因此安全性更高。本发明为绵羊的精确基因编辑提供了重要技术支撑。

公开(公告)号：CN114438225A

公开(公告)日：2022-05-06

申请号：CN202210142781.2

申请日：2022-02-16

Applicant: 西北农林科技大学

Inventor： 王小龙 ,  吴玉江 ,  李超 ,  陈炳春 ,  蔡蓓

IPC: C12Q1/6888 ,  C12N15/11 ,  C12Q1/6858

Abstract: 本发明属于遗传生物学技术领域，具体涉及一种与山羊低氧适应相关的结构变异分子标记及应用。所述结构变异分子标记位于山羊第26号染色体第42098934位碱基处的245bp插入/缺失，具体为如SEQ ID No.1所示核苷酸序列的第98bp处的插入缺失，插入/缺失的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明还提供了用于检测该结构变异分子标记的特异性引物对和检测方法，所述特异性引物对的序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。本发明所述结构变异分子标记不受山羊年龄、性别等因素的限制，可用于山羊高原低氧适应性引种和品种选育。

公开(公告)号：CN109679923A

公开(公告)日：2019-04-26

申请号：CN201910041468.8

申请日：2019-01-16

Applicant: 西北农林科技大学

Inventor： 陈玉林 ,  金妙函 ,  师丙波 ,  蔡蓓 ,  王小龙

IPC: C12N5/10 ,  C12N15/12 ,  C12N15/85 ,  C12N15/90

CPC classification number: C12N15/907 ,  C07K14/515 ,  C12N15/85 ,  C12N2800/80 ,  C12N2810/10

Abstract: 本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9系统生产VEGF164转基因细胞系的方法，步骤如下：构建针对毛囊特异启动子KAP6.1的3’UTR区的同源打靶载体PB-G-H-VEGF164-DsRed；设计并合成针对KAP6.1的3’UTR区的CRISPR/Cas9系统切割位点的sgRNA，将合成的sgRNA克隆入pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin构成sgRNA转录载体；将同源打靶载体、sgRNA转录载体及Cas9表达载体混合，转染绒山羊胎儿成纤维细胞，经过筛选后获得的阳性绒山羊胎儿成纤维细胞。本发明解决了纯合个体较难获得，基因插入效率较低的问题。

公开(公告)号：CN114262708A

公开(公告)日：2022-04-01

申请号：CN202111586529.2

申请日：2021-12-21

Applicant: 西北农林科技大学

Inventor： 王小龙 ,  周世卫 ,  陈玉林 ,  高亚伟 ,  王倩 ,  蔡蓓

IPC: C12N15/12 ,  C12N15/10 ,  C12N15/63 ,  C12N15/66 ,  C12N15/89 ,  C12N15/113 ,  C12N5/10 ,  C12Q1/6888 ,  C12N15/11

Abstract: 本发明公开了一种生产FecB基因g.A746G定点突变绵羊的试剂盒及其方法。所述的试剂盒中含有FecB‑pegRNA的体外转录模板质粒、FecB‑sgRNA的体外转录模板质粒以及PE2mRNA的体外转录模板质粒，以FecB‑pegRNA的体外转录模板质粒、FecB‑sgRNA的体外转录模板质粒为模板经PCR扩增得到的FecB‑pegRNA体外转录模板序列如SEQ ID No.4所示，FecB‑sgRNA体外转录模板序列如SEQ ID No.5所示。将体外转录获得的pegRNA、sgRNA及PE2mRNA纯化后混合，注射入绵羊受精卵细胞质中，受精卵体外培养后移植入同种雌性绵羊输卵管中，生产的后代经检测后获得FecB基因g.A746G定点突变绵羊。本发明模拟自然界中存在的FecB基因g.A746G绵羊，同时与传统CRISPR/Cas技术相比极大地避免了随机突变、bystander突变、脱靶突变及基因组损伤，因此安全性更高。本发明为绵羊的精确基因编辑提供了重要技术支撑。

公开(公告)号：CN109929878A

公开(公告)日：2019-06-25

申请号：CN201910234408.8

申请日：2019-03-26

Applicant: 西北农林科技大学

Inventor： 王小龙 ,  李冠纬 ,  周世卫 ,  蔡蓓 ,  陈玉林

IPC: C12N15/85 ,  C12N15/90 ,  A01K67/027

Abstract: 本发明公开了一种利用基因组碱基编辑器系统生产FGF5基因编辑山羊的方法，该方法包括以下步骤：构建特异性靶向FGF5第一外显子的sgRNA的体外转录载体；通过体外转录得到靶向FGF5第一外显子的sgRNA；体外转录BE3蛋白的体外转录载体，得到BE3 mRNA；将以上步骤的sgRNA及BE3 mRNA，纯化后混合，注射入山羊受精卵细胞质中，经体外培养后移植入同种雌性山羊输卵管中，用于生产FGF5基因敲除的基因编辑山羊。

公开(公告)号：CN109680011A

公开(公告)日：2019-04-26

申请号：CN201910041440.4

申请日：2019-01-16

Applicant: 西北农林科技大学

Inventor： 王小龙 ,  丁毅 ,  蔡蓓 ,  周世卫 ,  陈玉林 ,  寇启芳

IPC: C12N15/90 ,  C12N15/113 ,  C12N15/12 ,  A01K67/027

CPC classification number: C12N15/907 ,  A01K67/0276 ,  A01K2217/075 ,  A01K2227/103 ,  A01K2267/02 ,  C07K14/71 ,  C12N15/113 ,  C12N2310/10 ,  C12N2310/20

Abstract: 本发明公开了一种利用CRISPR/Cas9系统敲除绵羊BMPR1B基因的方法，包括以下步骤：构建特异性靶向BMPR1B的sgRNA的体外转录载体；通过体外转录得到BMPR1B的sgRNA；体外转录Cas9蛋白的体外转录载体，得到Cas9mRNA；设计合成ssODN；将以上步骤的ssODN、sgRNA及Cas9mRNA纯化后测浓度，混合，注射入绵羊受精卵细胞质中，然后经体外培养后移植入同种雌性绵羊输卵管中，用于生产敲除BMPR1B的转基因绵羊。利用此方法可以快速有效的生产基因编辑绵羊，省时省力。