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公开(公告)号：CN107177576B
公开(公告)日：2020-07-28
申请号：CN201710325569.9
申请日：2017-05-10
申请人： 浙江工业大学
摘要： 本发明公开了一种腈水解酶突变体及其应用，所述突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位，第339位和第343位氨基酸中的一位或多位进行突变获得的。本发明经过蛋白质分子改造，腈水解酶AcN纯酶的热稳定性最高提高了14倍，且利用含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌在高温下(45℃)水解1‑氰基环己基乙腈，反应时间缩短为原来的三分之一。因此，本发明所获得的突变体在高效催化1‑氰基环己基乙腈合成加巴喷丁中间体1‑氰基环己基乙酸中具有良好的应用前景。
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公开(公告)号：CN108486088A
公开(公告)日：2018-09-04
申请号：CN201810151771.9
申请日：2018-02-14
申请人： 浙江工业大学
摘要： 本发明公开了一种腈水解酶突变体及其应用，所述突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位氨基酸，或对第324-381位氨基酸序列进行一位或多位替换获得的。本发明经过蛋白质分子改造，腈水解酶LNIT5纯酶在45℃下的热稳定性最高提高了4.5倍，且利用含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌在高温下(45℃)水解1-氰基环己基乙腈，产物得率得到了提高。因此，本发明所获得的突变体在高效催化1-氰基环己基乙腈合成加巴喷丁中间体1-氰基环己基乙酸中具有良好的应用前景。
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公开(公告)号：CN104774825B
公开(公告)日：2017-11-07
申请号：CN201510127744.4
申请日：2015-03-23
申请人： 浙江工业大学
摘要： 本发明公开了一种腈水解酶突变体及其在R‑邻氯扁桃酸合成中的应用，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第132位苏氨酸或第189位苯丙氨酸进行单突变或双突变获得的；本发明所述的腈水解酶突变体较未突变的腈水解酶比酶活提高3.70倍，达到1.08U/mg，对映体选择性达到99％，且结果表明，腈水解酶突变体在两相体系中(甲苯：水＝2：8)，可催化300mM邻氯扁桃腈，产率90.8％，通过流加底物的方式，最高可催化500mM邻氯扁桃腈，产率90％，对映体选择性大于99％。
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公开(公告)号：CN107235850A
公开(公告)日：2017-10-10
申请号：CN201710396386.6
申请日：2017-05-31
申请人： 浙江工业大学
IPC分类号： C07C227/10 , C07C229/28 , C07C227/40 , C12P13/00
CPC分类号： C07C227/10 , C07C227/40 , C12P13/002 , C07C229/28
摘要： 本发明公开了一种利用1‑氰基环己基乙酸直接合成加巴喷丁的方法：将腈水解酶基因工程菌固定化细胞分散于去离子水中，加入1‑氰基环己基乙腈，在20‑50℃、10‑350rpm条件下搅拌反应完全后，抽滤，获得滤液a；取滤液a至加氢反应釜中，加入催化剂和助剂，通入氢气，于20‑150℃、300‑1100rpm条件下反应，反应完全后将反应液分离纯化得到加巴喷丁。通过助剂的添加和升温策略的改变，在最优条件下，反应一个批次加巴喷丁收率达53.3％；通过过对1‑氰基环己基乙酸的回收并进行加氢反应，经过5次循环后，使得加巴喷丁收率达到80％以上，比已报道的化学工艺提高了近20％。
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公开(公告)号：CN107177576A
公开(公告)日：2017-09-19
申请号：CN201710325569.9
申请日：2017-05-10
申请人： 浙江工业大学
摘要： 本发明公开了一种腈水解酶突变体及其应用，所述突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位，第339位和第343位氨基酸中的一位或多位进行突变获得的。本发明经过蛋白质分子改造，腈水解酶AcN纯酶的热稳定性最高提高了14倍，且利用含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌在高温下(45℃)水解1‑氰基环己基乙腈，反应时间缩短为原来的三分之一。因此，本发明所获得的突变体在高效催化1‑氰基环己基乙腈合成加巴喷丁中间体1‑氰基环己基乙酸中具有良好的应用前景。
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公开(公告)号：CN108486088B
公开(公告)日：2021-02-02
申请号：CN201810151771.9
申请日：2018-02-14
申请人： 浙江工业大学
摘要： 本发明公开了一种腈水解酶突变体及其应用，所述突变体是将SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位氨基酸，或对第324‑381位氨基酸序列进行一位或多位替换获得的。本发明经过蛋白质分子改造，腈水解酶LNIT5纯酶在45℃下的热稳定性最高提高了4.5倍，且利用含有腈水解酶突变体的重组大肠杆菌在高温下(45℃)水解1‑氰基环己基乙腈，产物得率得到了提高。因此，本发明所获得的突变体在高效催化1‑氰基环己基乙腈合成加巴喷丁中间体1‑氰基环己基乙酸中具有良好的应用前景。
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公开(公告)号：CN107235850B
公开(公告)日：2019-07-26
申请号：CN201710396386.6
申请日：2017-05-31
申请人： 浙江工业大学
IPC分类号： C07C227/10 , C07C229/28 , C07C227/40 , C12P13/00
摘要： 本发明公开了一种利用1‑氰基环己基乙酸直接合成加巴喷丁的方法：将腈水解酶基因工程菌固定化细胞分散于去离子水中，加入1‑氰基环己基乙腈，在20‑50℃、10‑350rpm条件下搅拌反应完全后，抽滤，获得滤液a；取滤液a至加氢反应釜中，加入催化剂和助剂，通入氢气，于20‑150℃、300‑1100rpm条件下反应，反应完全后将反应液分离纯化得到加巴喷丁。通过助剂的添加和升温策略的改变，在最优条件下，反应一个批次加巴喷丁收率达53.3％；通过过对1‑氰基环己基乙酸的回收并进行加氢反应，经过5次循环后，使得加巴喷丁收率达到80％以上，比已报道的化学工艺提高了近20％。
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公开(公告)号：CN104212850B
公开(公告)日：2017-06-13
申请号：CN201410395753.7
申请日：2014-08-12
申请人： 浙江工业大学
摘要： 本发明公开了一种利用腈水解酶工程菌制备1‑氰基环己基乙酸的方法：将含重组腈水解酶基因的工程菌经发酵培养后的培养液离心，以湿菌体作为催化剂，以1‑氰基环己基乙腈为底物，以pH值为3.0～10.0的缓冲液为反应介质，在25～70℃进行转化反应，反应结束后，获得含1‑氰基环己基乙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得1‑氰基环己基乙酸；所述含重组腈水解酶基因的工程菌由SEQ IDNO.2所示核苷酸序列编码基因构建而成；本发明所述含腈水解酶的工程菌作为催化剂，具有良好的区域选择性和催化活力，生产过程对环境友好。
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公开(公告)号：CN104212850A
公开(公告)日：2014-12-17
申请号：CN201410395753.7
申请日：2014-08-12
申请人： 浙江工业大学
摘要： 本发明公开了一种利用腈水解酶工程菌制备1-氰基环己基乙酸的方法：将含重组腈水解酶基因的工程菌经发酵培养后的培养液离心，以湿菌体作为催化剂，以1-氰基环己基乙腈为底物，以pH值为3.0～10.0的缓冲液为反应介质，在25～70℃进行转化反应，反应结束后，获得含1-氰基环己基乙酸的混合液，将混合液分离纯化，获得1-氰基环己基乙酸；所述含重组腈水解酶基因的工程菌由SEQ IDNO.2所示核苷酸序列编码基因构建而成；本发明所述含腈水解酶的工程菌作为催化剂，具有良好的区域选择性和催化活力，生产过程对环境友好。
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公开(公告)号：CN104212785A
公开(公告)日：2014-12-17
申请号：CN201410394475.3
申请日：2014-08-12
申请人： 浙江工业大学
CPC分类号： C12N9/78 , C12Y305/05001
摘要： 本发明公开了一种腈水解酶工程菌的高密度发酵方法，该方法采用全新的重组大肠杆菌发酵及补料培养基配方，通过采用DO-STAT偶联分步诱导，并分阶段逐步提高转速的方法，既满足了培养过程中随着生物量增加对搅拌功率的需要，又有效控制了菌体的生长速率，预防了菌体生长过快引起的产酸积累，反馈抑制，培养基浪费等弊端；此外，通过采用批次补加乳糖的诱导方式，既避免了乳糖浓度过高所引起的发酵液粘度增大，致使传氧、传质受阻问题，又提高了诱导强度，利用本发明的高密度发酵技术，重组大肠杆菌的生物量由10.35g DCW/L提高至70g DCW/L，体积酶活从18205U/L提高至103530U/L，使发酵水平提高了4.7倍。
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