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公开(公告)号：CN106591364B
公开(公告)日：2018-12-25
申请号：CN201611001075.7
申请日：2016-11-14
Applicant: 西北农林科技大学
IPC: C12N15/85 , C12N5/10 , A01K67/027
Abstract: 本发明公开了一种利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，本发明通过电穿孔的方法将供体载体和针对打靶位点的单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，供体载体中NRAMP1基因自身启动子可以使NRAMP1实现在专职吞噬性细胞中的特异性表达，嘌呤霉素药物筛选后，经过PCR和Southern Blotting鉴定获得打靶的阳性克隆细胞。以该转基因阳性克隆细胞为核供体，可获得转基因克隆胚胎，进一步将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫内，最终可以获得成活的NRAMP1定点插入转基因克隆牛。
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公开(公告)号：CN106086080B
公开(公告)日：2018-12-04
申请号：CN201610537461.1
申请日：2016-07-08
Applicant: 西北农林科技大学
IPC: C12N15/877 , C12N5/073
Abstract: 本发明公开了一种利用微小核糖核酸提高牛克隆效率的方法，在体细胞核移植的电融合液中加入bta‑miR‑125b mimic，可以有效地导入到胚胎中，在避免产生转染的二次损伤的同时，还能有效地减弱体细胞克隆胚在合子激活时期的组蛋白H3K9me3表观遗传修饰水平，显著提高牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量。
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公开(公告)号：CN108410894A
公开(公告)日：2018-08-17
申请号：CN201810187279.7
申请日：2018-03-07
Applicant: 西北农林科技大学
IPC: C12N15/63 , C12N15/89 , C12N15/877
Abstract: 本发明公开了一种基于组蛋白甲基化水平的修饰提高牛克隆效率的载体及方法。本发明提供的载体包括含有牛KDM4E基因的体外转录模板载体。载体经体外转录反应可获得大量牛KDM4E基因的mRNA，再将其注入到成功融合并激活的牛体细胞克隆胚胎中，使胚胎过量表达牛KDM4E蛋白。本发明可以有效减弱体细胞克隆胚胎在合子激活时期的组蛋白H3K9me3和H3K9me2表观遗传修饰水平，从而显著提高后期牛体细胞克隆囊胚的发育率和质量，可用以高效体外生产牛体细胞克隆胚胎，胚胎移植后克隆牛的出生率也显著提高。
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公开(公告)号：CN104726495B
公开(公告)日：2018-06-19
申请号：CN201510131862.2
申请日：2015-03-25
Applicant: 西北农林科技大学 , 杨凌科元克隆股份有限公司
IPC: C12N15/85 , C12N15/55 , C12N15/12 , C12N5/10 , C12N15/873
Abstract: 本发明公开了一种基于TALEN介导的基因打靶敲除山羊BLG的载体及重组细胞。本发明根据山羊β‑乳球蛋白基因，设计并构建了针对其第一外显子的TALEN真核表达载体以及含有较短同源臂的BLG基因敲除载体，与以TALEN表达载体为模板体外转录的mRNAs共同转染山羊胎儿成纤维细胞，经药物筛选及鉴定后得到β‑乳球蛋白基因敲除细胞。本发明利用TALEN技术大大提高了基因打靶效率，同时较短同源臂的利用可以更方便高效的进行中靶细胞的筛选，mRNAs的利用则避免了TALEN表达载体在基因组中的随机整合。
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公开(公告)号：CN107916249A
公开(公告)日：2018-04-17
申请号：CN201711117369.0
申请日：2017-11-13
Applicant: 西北农林科技大学
IPC: C12N5/073
CPC classification number: C12N5/0604 , C12N2500/12 , C12N2500/16 , C12N2500/30 , C12N2500/32 , C12N2501/998 , C12N2501/999
Abstract: 本发明提供了一种提高牛体细胞克隆胚和体外受精胚的发育质量的培养液和培养方法，培养液包括体积分数2％的BME、体积分数1％的MEM、1mmol/L的谷氨酰胺、8mg/mL的BSA、50μg/mL的庆大霉素及50μg/mL的头孢霉素，在体外培养牛胚胎到第96h后，添加体积分数5％的KSR；利用上述培养液进行牛体细胞克隆胚及体外受精胚体外培养，结果显示囊胚发育率和质量均显著高于对照组，运用本发明可以高效率的获得牛体细胞克隆胚胎或体外受精胚胎。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN105543164A
公开(公告)日：2016-05-04
申请号：CN201610112297.X
申请日：2016-02-29
Applicant: 西北农林科技大学
IPC: C12N5/071
CPC classification number: C12N5/0631 , C12N2509/00
Abstract: 本发明公开了一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法：将泌乳期奶牛的乳腺组织剪切成组织块后用胶原酶/透明质酸酶消化液消化，将消化后呈乳糜状的组织块接种在培养皿进行培养，1～2天后组织块周围即有细胞游离出组织并贴壁生长，之后培养期间，每天采用机械刮除法去除梭形样成纤维细胞，直至大约4～5天后大量铺路石样乳腺上皮细胞成簇成片生长并互相融合时进行首次传代。首次传代时利用差速消化法使用胰蛋白酶消除可能混杂的极少量成纤细胞，即得到纯度很高的奶牛乳腺上皮细胞。本方法中乳腺上皮细胞可以在短时间从乳糜状组织中迁出；并且主要采用机械刮除法去除少量混杂的成纤维细胞污染，因此获得的乳腺上皮细胞损伤小、纯度高。
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公开(公告)号：CN103160534B
公开(公告)日：2015-02-25
申请号：CN201310100213.7
申请日：2013-03-26
Applicant: 西北农林科技大学 , 杨凌科元克隆股份有限公司
Abstract: 本发明公开了一种通用型牛β-酪蛋白位点基因打靶载体及其构建方法。所构建的载体包括5’同源臂和3’同源臂，以牛β-酪蛋白位点第二内含子锌指核酸酶识别位点的上下游各延伸700～850bp的同源序列作为5’同源臂和3’同源臂。本发明通过锌指核酸酶在DNA的特定位点产生缺口，通过同源重组末端接合来实现基因敲除，从而大大提高了基因敲除的效率；然后利用同源重组的方法将目的基因整合到体细胞的靶位点上，在打靶载体筛选基因和标记基因的两端加上Loxp序列便于后续工作中去除筛选基因和标记基因，从而提高体细胞克隆的效率。
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公开(公告)号：CN102634535B
公开(公告)日：2014-11-26
申请号：CN201210106175.1
申请日：2012-04-12
Applicant: 西北农林科技大学 , 杨凌科元克隆股份有限公司
Abstract: 本发明公开了一种随机锌指蛋白库的构建方法，包括锌指蛋白表达插入载体pBD-P-Gal11p-ZFR的构建、随机锌指蛋白序列的构建以及随机锌指蛋白表达载体pBD-P-Gal11p-ZFS构建，在将其转化并表达后获得高容量的随机锌指蛋白库。该高容量的随机锌指蛋白库，为锌指蛋白的筛选奠定了基础。
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公开(公告)号：CN102533857B
公开(公告)日：2014-05-07
申请号：CN201210039495.X
申请日：2012-02-21
Applicant: 西北农林科技大学 , 杨凌科元克隆股份有限公司
IPC: C12N15/85 , C12N5/10 , C12N15/873
Abstract: 本发明公开了一种包含HBD3气管上皮细胞异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞，构建了一种包含HBD3气管上皮细胞异性表达载体Muc1-loxp-EGFP-HBD3，以及基于该载体的包含HBD3气管上皮细胞异性表达载体的牛胎儿成纤维细胞系，利用该细胞系作为核供体细胞，为解决奶牛结核病的转基因奶牛提供坚实的基础。本发明通过电转染法将外源性表达载体Muc1-loxp-EGFP-HBD3导入牛胎儿成纤维细胞，荧光显微镜观察标记基因EGFP的表达情况，并经G418筛选获得阳性细胞，经PCR鉴定，证实目的基因HBD3整合到牛胎儿成纤维细胞的基因组；最后，将转染HBD3基因的牛胎儿成纤维细胞作为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚。
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公开(公告)号：CN102426126B
公开(公告)日：2013-04-24
申请号：CN201110251106.5
申请日：2011-08-29
Applicant: 西北农林科技大学
IPC: G01N1/30
Abstract: 本发明公开了一种牛囊胚内细胞团细胞和滋养层细胞的差异染色方法，包括以下步骤：1)利用免疫染色方法，以抗CDX2单克隆抗体作为一抗，将其与特异表达在牛囊胚滋养层细胞的CDX2分子进行免疫结合；2)利用免疫染色方法，以红色荧光标记的能够与抗CDX2单克隆抗体结合的抗体作为二抗，对清洗后的结合有一抗的牛囊胚进行免疫染色；3)在免疫染色完成后，对牛囊胚进行整体的细胞核荧光染色，以形成差异染色。本发明在CDX2蛋白在滋养层细胞内特异性表达，而在内细胞团细胞上不表达的基础上，这样利用基于CDX2分子的红色免疫染色和DAPI细胞核蓝色染色来进行差异染色，准确率为100％，而且图片清晰漂亮。
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