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公开(公告)号：CN106591364B
公开(公告)日：2018-12-25
申请号：CN201611001075.7
申请日：2016-11-14
Applicant: 西北农林科技大学
IPC: C12N15/85 , C12N5/10 , A01K67/027
Abstract: 本发明公开了一种利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，本发明通过电穿孔的方法将供体载体和针对打靶位点的单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，供体载体中NRAMP1基因自身启动子可以使NRAMP1实现在专职吞噬性细胞中的特异性表达，嘌呤霉素药物筛选后，经过PCR和Southern Blotting鉴定获得打靶的阳性克隆细胞。以该转基因阳性克隆细胞为核供体，可获得转基因克隆胚胎，进一步将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫内，最终可以获得成活的NRAMP1定点插入转基因克隆牛。
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公开(公告)号：CN104293833A
公开(公告)日：2015-01-21
申请号：CN201410528091.6
申请日：2014-10-09
Applicant: 西北农林科技大学 , 杨凌科元克隆股份有限公司
IPC: C12N15/85 , C12N5/10 , C12N15/873
Abstract: 本发明公开了一种基于TALEN介导的Sp110巨噬细胞特异打靶载体及重组细胞，对牛胎儿成纤维细胞进行基因打靶获得的M-S位点定点敲入Sp110基因的牛胎儿成纤维细胞。利用打靶载体中的MSR1启动子，使得定点敲入的Sp110在且仅在牛的外周血巨噬细胞中正常转录和表达。本发明利用电穿孔的方法将打靶载体和TALEN位点特异性核酸切割酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，通过PCR和Southern Blotting筛选和验证获得了打靶的阳性克隆细胞。以该阳性克隆细胞为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚胎。将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫中，最终生产成活的转基因克隆牛。
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公开(公告)号：CN104293833B
公开(公告)日：2017-10-10
申请号：CN201410528091.6
申请日：2014-10-09
Applicant: 西北农林科技大学 , 杨凌科元克隆股份有限公司
IPC: C12N15/85 , C12N5/10 , C12N15/873
Abstract: 本发明公开了一种基于TALEN介导的Sp110巨噬细胞特异打靶载体及重组细胞，对牛胎儿成纤维细胞进行基因打靶获得的M‑S位点定点敲入Sp110基因的牛胎儿成纤维细胞。利用打靶载体中的MSR1启动子，使得定点敲入的Sp110在且仅在牛的外周血巨噬细胞中正常转录和表达。本发明利用电穿孔的方法将打靶载体和TALEN位点特异性核酸切割酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，通过PCR和Southern Blotting筛选和验证获得了打靶的阳性克隆细胞。以该阳性克隆细胞为核供体移入牛去核卵母细胞，获得转基因克隆胚胎。将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫中，最终生产成活的转基因克隆牛。
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公开(公告)号：CN106591364A
公开(公告)日：2017-04-26
申请号：CN201611001075.7
申请日：2016-11-14
Applicant: 西北农林科技大学
IPC: C12N15/85 , C12N5/10 , A01K67/027
CPC classification number: C12N15/85 , A01K67/0276 , A01K2227/101 , A01K2267/02 , C07K14/47 , C12N5/0656 , C12N2800/107 , C12N2800/80
Abstract: 本发明公开了一种利用单一Cas9切口酶介导NRAMP1定点插入获取转基因牛胎儿成纤维细胞的方法，本发明通过电穿孔的方法将供体载体和针对打靶位点的单一CRISPR/Cas9切口酶表达载体共转染牛胎儿成纤维细胞，供体载体中NRAMP1基因自身启动子可以使NRAMP1实现在专职吞噬性细胞中的特异性表达，嘌呤霉素药物筛选后，经过PCR和Southern Blotting鉴定获得打靶的阳性克隆细胞。以该转基因阳性克隆细胞为核供体，可获得转基因克隆胚胎，进一步将转基因克隆胚胎移植到发情的受体牛子宫内，最终可以获得成活的NRAMP1定点插入转基因克隆牛。
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