公开(公告)号：CN113265449A

公开(公告)日：2021-08-17

申请号：CN202110651600.4

申请日：2021-06-11

Applicant: 扬州大学

Inventor： 李碧春 ,  张晨 ,  左其生 ,  张亚妮 ,  孙红艳

IPC: C12Q1/6858 ,  C12Q1/66

Abstract: 本发明涉及一种研究基因启动子区DNA甲基化和组蛋白甲基化调控模式的方法，包括以下步骤：确定DNA甲基化对目的基因的调控、确定组蛋白H3K4me2/3对目的基因的调控、确定DNA甲基化和组蛋白H3K4me2/3对目的基因的表达调控；确定何种表观遗传修饰对目的基因起主要调控作用。通过本发明，本方法简单可行，具有可行性，操作简便，研究思路清晰可靠，具有广泛应用性，因DNA甲基化和组蛋白甲基化具有高度保守性，因此在不同物种或不同生物学过程中均能使用该方法研究DNA甲基化和组蛋白甲基化对基因表达的调控模式。

公开(公告)号：CN112481200A

公开(公告)日：2021-03-12

申请号：CN202011555174.6

申请日：2020-12-25

Applicant: 扬州大学

Inventor： 孙小林 ,  顾翔 ,  徐佩 ,  李红校 ,  朱业 ,  左其生 ,  李碧春

IPC: C12N5/077 ,  C12N5/10 ,  C12N5/0775 ,  C12N15/867

Abstract: 本发明涉及一种提升大鼠骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞效率的方法，包括以下步骤：（1）构建慢病毒干扰载体G9a‑shRNA，将G9a‑shRNA转染至大鼠骨髓间充质干细胞；（2）通过5‑氮杂胞苷诱导转染干扰载体后的骨髓间充质干细胞，在第21天的时候流式细胞检测肌钙蛋白阳性细胞的阳性率。通过本发明，在5‑氮杂胞苷诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌细胞过程中，敲低H3K9me2甲基化酶G9a，观察其最终诱导效率，以期为骨髓间充质干细胞分化心肌细胞过程中寻找一种方便、快速的途径。采用FuGENE（Promega）脂质体介导G9a‑shRNA慢病毒重组质粒转染大鼠骨髓间充质干细胞，以减低H3K9me2的表达的方法，从而增加诱导效率，验证结果合理准确，实验过程严密周谨。

公开(公告)号：CN111893091A

公开(公告)日：2020-11-06

申请号：CN202010861186.5

申请日：2020-08-25

Applicant: 扬州大学

Inventor： 孙小林 ,  顾翔 ,  徐佩 ,  李红校 ,  朱业 ,  左其生 ,  李碧春 ,  姜江 ,  董晓娜 ,  韦玮

IPC: C12N5/077 ,  C12N5/074

Abstract: 本发明涉及一种诱导大鼠极小胚胎干细胞分化为心肌细胞的方法，包括以下步骤：（1）、通过流式细胞仪分选获得大鼠骨髓中CD45−Lin−CD106+细胞(极小胚胎干细胞)；（2）、5-氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞分化；（3）、通过qRT-PCR，免疫荧光检测心肌蛋白相关基因，验证5-氮杂胞苷诱导极小胚胎干细胞分化过程。通过本发明，旨在从大鼠骨髓组织中分离培养出极小胚胎干细胞，并采用5-氮杂胞苷诱导分化，观察其生物学特性及定向分化特征，以期为临床缓慢性心律失常的细胞移植治疗寻找一种方便、快速的途径。验证结果合理准确，实验过程严密周谨。

公开(公告)号：CN111778289A

公开(公告)日：2020-10-16

申请号：CN202010734335.1

申请日：2020-07-27

Applicant: 扬州大学

Inventor： 李碧春 ,  高雯 ,  左其生 ,  张晨 ,  袁霞 ,  姜景译 ,  丁颖 ,  张亚妮 ,  孙红艳

IPC: C12N15/90 ,  C12N15/867

Abstract: 一种利用CRISPR-Cas9靶向敲除鸡Bmp4基因的方法，属于生物技术领域。本发明通过基因编辑技术沉默基因的表达为基因功能的研究提供了重要的技术手段，RISPR-Cas9系统属于基因编辑技术中的一种，具有敲除效率高、操作简单、成本低等优点。为此，本发明利用RISPR-Cas9技术构建Bmp4敲除载体，不仅能够从基因组上抑制Bmp4的表达，为更准确地研究Bmp4基因在鸡原始生殖细胞（Primordial germ cells,PGCs）形成过程中的功能提供实验素材，而且也有利于为将来构建基因敲除鸡模型奠定实验基础。

公开(公告)号：CN111690673A

公开(公告)日：2020-09-22

申请号：CN202010571400.3

申请日：2020-06-22

Applicant: 扬州大学

Inventor： 左其生 ,  姜景译 ,  李碧春 ,  金晶 ,  袁霞 ,  张晨

IPC: C12N15/62 ,  C12N15/12 ,  C12N15/70 ,  G01N33/68

Abstract: 一种lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的验证方法，属于生物技术领域。利用在线软件ORF Finder预测lncRNA-BMP4可能存在的开放阅读框并构建原核融合表达载体，通过Western Blot检测获得的诱导蛋白。本方法简单易行，思路清晰，操作可行性高，在普通研究室就能完成。本发明将lncRNA通过编码小肽促进PGCs形成的研究扩展到家禽领域，并准确定位到lncRNA-BMP4上，刷新了不同物种中lncRNA通过编码小肽形成功能的范畴。

公开(公告)号：CN111690594A

公开(公告)日：2020-09-22

申请号：CN202010685364.3

申请日：2020-07-16

Applicant: 扬州大学

Inventor： 左其生 ,  靳锴 ,  李碧春 ,  张亚妮 ,  孙红艳

IPC: C12N5/073 ,  C12N5/077 ,  C12Q1/6888 ,  C12Q1/6879 ,  C12Q1/06 ,  G01N33/68

Abstract: 本发明涉及一种鸡两性CEF的体外分离和培养方法，包括以下步骤：（1）对孵化9-10日龄的早期胚蛋进行消毒，取出胚胎后剥离出皮肤，同时采取胚胎血液进行性别鉴定，取出不同性别的皮肤组织；（2）将不同性别的皮肤组织进行消化和过滤，计数后进行培养；（3）观察不同性别皮肤组织的CEF细胞，并采取样本进行鉴定。本发明与提供了一种鸡两性CEF的体外分离和培养方法，可以准确的分离鸡两性CEF，可用于禽类性别决定和分化模型的建立，单一性别的CEF能够提高其作为疾病模型的相关研究中的准确性和可信度。本发明中的性别鉴定和两性CEF的分离培养方法也可以应用于其他禽类研究中，具有很好的推广应用价值。

公开(公告)号：CN111676299A

公开(公告)日：2020-09-18

申请号：CN202010749121.1

申请日：2020-07-30

Applicant: 扬州大学

Inventor： 李碧春 ,  石祥 ,  左其生 ,  张亚妮 ,  孙红艳

IPC: C12Q1/6888 ,  C12Q1/6869

Abstract: 本发明涉及一种鉴定鸡囊胚配盘中细胞种类的方法，包括以下步骤：（1）消毒；取刚产出体外的新鲜受精蛋，使用1%新洁尔灭清洗蛋壳，再用75%酒精擦拭蛋壳表明进行消毒；（2）取样；在超净台中药勺法取出新鲜受精蛋的胚盘，PBS清洗三遍，用移液枪轻轻吹匀，制备成单细胞悬液；（3）单细胞测序仪器进行上机建库；（4）对测序数据进行分析；（5）细胞亚群的鉴定。通过本发明，可以准确的鉴定胚盘中细胞的种类，与传统的测序方式不同，单细胞测序可以检测细胞之间的异质性，在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组进行高通量测序分析，在相关研究中具有极高的准确性和可信度。

公开(公告)号：CN111650327A

公开(公告)日：2020-09-11

申请号：CN202010685235.4

申请日：2020-07-16

Applicant: 扬州大学

Inventor： 左其生 ,  靳锴 ,  李碧春 ,  张亚妮 ,  孙红艳

IPC: G01N30/88

Abstract: 本发明涉及一种基于非标定量蛋白质组学技术寻找如皋黄鸡不同细胞或组织间差异表达蛋白的方法，包括以下步骤：（1）鸡不同细胞或组织的组织或细胞蛋白提取；（2）对步骤（1）中得到的不同组的细胞或组织蛋白进行胰酶酶解；（3）酶解后的细胞或组织蛋白进行液相色谱-质谱联用分析；（4）对分析结果进行数据库搜库和注释分析。通过本发明，本发明的优越性在于：1、本发明能够较快的获得不同组织和细胞之间的差异表达蛋白。2、方法简单可行，可重复性强，结果准确。3、该方法适用于其他物种。

公开(公告)号：CN105838667B

公开(公告)日：2019-10-18

申请号：CN201610252413.8

申请日：2016-04-21

Applicant: 扬州大学

Inventor： 张亚妮 ,  左其生 ,  李碧春 ,  王颖洁 ,  汤贝贝 ,  李东 ,  纪艳芹 ,  连超 ,  王飞 ,  路镇宇

IPC: C12N5/0735 ,  C12N5/073 ,  C12Q1/6851 ,  G01N33/68

Abstract: 本发明公开了一种TGF‑β信号通路在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能验证方法：首先基于RNA‑seq数据源进行关键信号通路富集并筛选；利用TGFβ受体抑制剂:LY2109761，BMP4受体抑制剂:LDN193189在体内和体外两个水平对TGF‑β信号通路进行抑制以验证该通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的具体功能；设计LY2109761+BMP4，LDN193189+BMP4以及Double+BMP4实验组进行实验，实验过程中每个1d，取样一次。检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用间接免疫荧光和FACS检测各分组中细胞诱导后interginα6+interginβ1+细胞数量；采用鸡胚注射方式将抑制剂注射鸡胚，设计实验组：LY2109761，LDN193189以及Double组，孵化过程中于4d和18d取样，检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用组织免疫化学和FACS检测各分组中18d后睾丸中interginα6+interginβ1+细胞数量。

公开(公告)号：CN110257426A

公开(公告)日：2019-09-20

申请号：CN201910547131.4

申请日：2019-06-24

Applicant: 扬州大学

Inventor： 李碧春 ,  姜景译 ,  左其生 ,  王曼 ,  李建成 ,  张明 ,  石祥 ,  袁霞

IPC: C12N15/85 ,  G01N21/64 ,  G16B20/30

Abstract: 本发明涉及一种研究鸡ESCs向PGCs分化过程中lin28调节Blimp1表达的方法，属于生物技术领域。本发明将Lin28通过micRNA-let7间接调控PGCs标记基因Blimp1的研究扩展到家禽领域，并准确定位到gga-let-7a-2-3p上，刷新了不同物种的Lin28-let7-Blimp1调节链的功能范畴。本方法简单易行，思路清晰，操作可行性高，在普通研究室就能完成。