公开(公告)号：CN105821116A

公开(公告)日：2016-08-03

申请号：CN201610237236.6

申请日：2016-04-15

Applicant: 扬州大学

Inventor： 李碧春 ,  汤贝贝 ,  张亚妮 ,  王颖洁 ,  左其生 ,  李东 ,  纪艳芹 ,  连超 ,  王飞 ,  路镇宇

IPC: C12Q1/66 ,  C12Q1/44 ,  G01N33/68

CPC classification number: C12Q1/66 ,  C12Q1/44 ,  G01N33/68 ,  G01N2333/47

Abstract: 本发明公开了一种应用CRISPR/Cas9技术对绵羊MSTN基因进行定向敲除，并验证其对骨骼肌卫星细胞分化影响效果的方法，具体内容如下：(1)目的基因克隆；(2)gRNA设计及合成；(3)CRISPR/Cas9基因敲除载体构建；(4)CRISPR/Cas9基因敲除载体外源活性检测；(5)CRISPR/Cas9基因敲除载体内源活性检测；(6)CRISPR/Cas9基因敲除载体敲除效果检测。本发明的优越性在于：1、实验周期较短速；2、方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行；3、运用该方法构建的活性载体，毒副作用小，可用于转基因动物的制备与生产；4、该方法非特异剪切较少，显著提高了基因靶向敲除效率高。5、该方法适用性高。

公开(公告)号：CN105838667A

公开(公告)日：2016-08-10

申请号：CN201610252413.8

申请日：2016-04-21

Applicant: 扬州大学

Inventor： 张亚妮 ,  左其生 ,  李碧春 ,  王颖洁 ,  汤贝贝 ,  李东 ,  纪艳芹 ,  连超 ,  王飞 ,  路镇宇

IPC: C12N5/0735 ,  C12N5/073 ,  C12Q1/68 ,  G01N33/68

Abstract: 本发明公开了一种新的TGF?β信号通路在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能验证方法：首先基于RNA?seq数据源进行关键信号通路富集并筛选；利用TGFβ受体抑制剂:LY2109762，BMP4受体抑制剂:LDN193189在体内和体外两个水平对TGF?β信号通路进行抑制以验证该通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的具体功能；设计LY2109762+BMP4，LDN193189+BMP4以及Double+BMP4实验组进行实验，实验过程中每个1d，取样一次。检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用间接免疫荧光和FACS检测各分组中细胞诱导后interginα6+interginβ1+细胞数量；采用鸡胚注射方式将抑制剂注射鸡胚，设计实验组：Y2109762，LDN193189以及Double组，孵化过程中于4d和18d取样，检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用组织免疫化学和FACS检测各分组中18d后睾丸中interginα6+interginβ1+细胞数量。

公开(公告)号：CN107043764A

公开(公告)日：2017-08-15

申请号：CN201611215943.1

申请日：2016-12-26

Applicant: 扬州大学

Inventor： 李碧春 ,  左其生 ,  王颖洁 ,  张亚妮 ,  汤贝贝 ,  李东 ,  纪艳芹 ,  连超 ,  王飞 ,  路镇宇

IPC: C12N15/10 ,  G01N27/62

CPC classification number: C12N15/1055 ,  G01N33/6848

Abstract: 本发明公开了一种基于GST‑Pull Down以及质谱分析技术寻找如皋黄鸡基因互作蛋白的方法：（1）目的基因克隆以及原核表达载体构建；（2）Pet‑49(b)‑GST‑目的基因的原核融合表达载体构建；（3）Pet‑49(b)‑GST‑目的基因进行原核表达；（4）对蛋白进行大量表达和破菌检测；（5）明确蛋白的表达位置后对表达的蛋白进行纯化和浓缩并进行GST‑Pull Down试验；（6）GST‑Pull Down后的蛋白进行蛋白质还原烷基化和胶内酶解并通过LC‑MS/MS鉴定获取目的基因的互作蛋白的序列。本发明能够较快的获得相关基因的互作蛋白；方法简单易行，可重复性强，在普通实验室即可进行。

公开(公告)号：CN105838667B

公开(公告)日：2019-10-18

申请号：CN201610252413.8

申请日：2016-04-21

Applicant: 扬州大学

Inventor： 张亚妮 ,  左其生 ,  李碧春 ,  王颖洁 ,  汤贝贝 ,  李东 ,  纪艳芹 ,  连超 ,  王飞 ,  路镇宇

IPC: C12N5/0735 ,  C12N5/073 ,  C12Q1/6851 ,  G01N33/68

Abstract: 本发明公开了一种TGF‑β信号通路在如皋黄鸡雄性生殖细胞分化过程中功能验证方法：首先基于RNA‑seq数据源进行关键信号通路富集并筛选；利用TGFβ受体抑制剂:LY2109761，BMP4受体抑制剂:LDN193189在体内和体外两个水平对TGF‑β信号通路进行抑制以验证该通路在鸡雄性生殖细胞分化过程中的具体功能；设计LY2109761+BMP4，LDN193189+BMP4以及Double+BMP4实验组进行实验，实验过程中每个1d，取样一次。检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用间接免疫荧光和FACS检测各分组中细胞诱导后interginα6+interginβ1+细胞数量；采用鸡胚注射方式将抑制剂注射鸡胚，设计实验组：LY2109761，LDN193189以及Double组，孵化过程中于4d和18d取样，检测Smad2，Smad5的表达变化以及生殖标记基因的表达变化，利用组织免疫化学和FACS检测各分组中18d后睾丸中interginα6+interginβ1+细胞数量。

公开(公告)号：CN105838791A

公开(公告)日：2016-08-10

申请号：CN201610252399.1

申请日：2016-04-21

Applicant: 扬州大学

Inventor： 李碧春 ,  李东 ,  张亚妮 ,  纪艳芹 ,  王飞 ,  汪怡临 ,  王颖洁 ,  路镇宇 ,  靳锴 ,  何娜娜

IPC: C12Q1/68

CPC classification number: C12Q1/6869 ,  C12Q2537/165 ,  C12Q2535/122

Abstract: 本发明公开了一种挖掘鸡胚胎干细胞向雄性生殖细胞分化过程中关键lncRNA的分析方法，本方法首先从如皋黄鸡的新鲜受精蛋的胚盘、第19期(72h)的生殖脊和第18天的睾丸，分离出鸡ESCs、PGCs和SSCs,并根据CDH1基因设计特异性，以PCR扩增的方法进行性别鉴定，对运用抗体标记的ESCs、PGCs和SSCs进行分选,阳性细胞提取细胞总RNA，纯化后对RNA质量进行检测，检测合格后进行RNA?Seq测序。将测序结果中筛选出组装RNA的转录本。分离鸡ESCs，PGCs和SSCs，提取总RNA，反转录为cDNA。对候选的lncRNA进行Trans和Cis靶基因的预测分析，并通过DAVID数据库查找其GO功能项，再通过GO分析注释其功能，对其进行功能分析。绘制关键lncRNA及其靶基因与相关信号通路之间的关系互作网络图。