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公开(公告)号：CN106191181B
公开(公告)日：2019-12-13
申请号：CN201610587122.4
申请日：2016-07-22
申请人： 江苏江山聚源生物技术有限公司
摘要： 本发明公开了一种毕赤酵母表达重组蛋白的发酵工艺，采用巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris为菌种，先进行一级种子培养，至菌浓为20±2g/L时转接二级种子培养，二级种子培养至菌浓为120±10g/L时转接至甘油培养阶段，甘油培养阶段中甘油的添加量为60～70g/L，待溶氧迅速上升到达相对稳定状态时，进入甲醇诱导阶段，诱导120±8h后，发酵结束。本发明减少了原有工艺中的甘油流加阶段，甘油消耗完即进入下一阶段，不再需要准备流加用无菌甘油，精简了甘油灭菌罐，减少了能源、资源的损耗以及甘油的浪费；同时无需再监控菌体浓度，降低了出错几率，减少因技术失误而导致的发酵失败，更适合大规模工业化生产，为重组蛋白的工业化生产带来便利和极大的经济价值。
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公开(公告)号：CN106008702B
公开(公告)日：2019-11-26
申请号：CN201610585372.4
申请日：2016-07-22
申请人： 江苏江山聚源生物技术有限公司
摘要： 本发明公开了一种规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法，通过将线性重组蛋白进行初折叠和重折叠，精确控制蛋白分子的空间半径，既有利于微滤和超滤膜孔径的精确选型，又可提高蛋白的回收率，联合应用微滤和超滤，分别去除大分子和小分子杂质，同时超滤实现蛋白浓缩，减轻了后期凝胶柱层析分离的负荷，再通过加入尿素，实现重组蛋白折叠后的解旋，避免了有害物的残留。本发明方法获得的重组人源胶原蛋白，纯度可达99％，回收率高于65％，方法操作简便，显著降低了重组人源胶原蛋白的规模化生产的成本，特别适合工业化生产。
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公开(公告)号：CN108048511A
公开(公告)日：2018-05-18
申请号：CN201810050089.0
申请日：2018-01-18
申请人： 江苏江山聚源生物技术有限公司
摘要： 本发明公开了一种调节pH提升重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺。所述工艺首先将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，初始生长阶段控制pH为5.2～5.4，发酵培养14～18小时后，调节pH至4.8～5.0，开始补加甲醇进行诱导表达。本发明在发酵过程中，选取在甲醇诱导表达阶段降低pH值，控制菌种生长，同时提高了重组人源胶原蛋白的生物合成速率，能够进一步提高重组人源胶原蛋白的生物合成速率，发酵时间缩短，同时重组人源胶原蛋白的表达量增加，发酵水平提高了20％以上，节约了生产成本，特别适用于重组人源胶原蛋白的工业化大规模生产，能够为产业化生产带来巨大的实际应用价值。
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公开(公告)号：CN107988292B
公开(公告)日：2023-12-26
申请号：CN201810049618.5
申请日：2018-01-18
申请人： 江苏江山聚源生物技术有限公司
摘要： 本发明公开了一种提高重组人源胶原蛋白稳定性的发酵工艺。所述工艺将重组毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，经过甘油流加和甲醇流加诱导表达阶段，在甲醇诱导84h后，向发酵罐中一次性添加0.2～0.5M L‑赖氨酸或L‑精氨酸。本发明能有效防止目的产物被蛋白酶降解，使用的氨基酸分子量小，后续提取易除去，而且成本比酪蛋白水解物低，为规模化生产减少损失，带来实际应用价值。
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公开(公告)号：CN109680025B
公开(公告)日：2022-05-13
申请号：CN201811590514.1
申请日：2018-12-25
申请人： 江苏江山聚源生物技术有限公司
摘要： 本发明公开了一种提高重组人源胶原蛋白生产水平且降低蛋白降解速度的发酵工艺。所述工艺首先将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，酵培养，在甲醇诱导培养阶段向发酵培养基中加入0.1～10g/L的柠檬酸铵。本发明在发酵过程中，选取在甲醇诱导表达阶段加入柠檬酸铵，提高了重组人源胶原蛋白的生物合成速率，并且采用连续流加的方式，能够进一步提高重组人源胶原蛋白的生物合成速率，发酵时间缩短，同时重组人源胶原蛋白的表达量增加，发酵水平提高了20％以上，同时也提高了重组人源胶原蛋白在发酵液中的稳定性，节约了生产成本，特别适用于重组人源胶原蛋白的工业化大规模生产，能够为产业化生产带来巨大的实际应用价值。
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公开(公告)号：CN114045321A
公开(公告)日：2022-02-15
申请号：CN202111601392.3
申请日：2021-12-24
申请人： 江苏江山聚源生物技术有限公司
摘要： 本发明公开了一种谷胱甘肽在发酵生产重组人源胶原蛋白中的应用。本发明通过在甲醇诱导表达阶段加入谷胱甘肽，提高了重组人源胶原蛋白的生物合成速率，并且采用连续流加的方式，能够进一步提高重组人源胶原蛋白的生物合成速率，缩短发酵时间，同时重组人源胶原蛋白的表达量增加，发酵水平提高了20％以上，促进重组人源胶原蛋白的工业化大规模生产。
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公开(公告)号：CN107988294A
公开(公告)日：2018-05-04
申请号：CN201810050088.6
申请日：2018-01-18
申请人： 江苏江山聚源生物技术有限公司
摘要： 本发明公开了一种调节温度提高重组人源胶原蛋白生产水平的发酵工艺。所述工艺首先将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，初始培养温度为30～32℃，发酵培养14～18小时后，调节培养温度至27～29℃，开始补加甲醇进行诱导表达。本发明在发酵过程中，在不同的培养阶段控制不同的温度，有利于菌种生长，同时提高了重组人源胶原蛋白的表达合成速率，能够进一步提高重组人源胶原蛋白的生物合成速率，缩短发酵时间，同时重组人源胶原蛋白的表达量增加，发酵水平提高了20％以上，节约了生产成本，特别适用于重组人源胶原蛋白的工业化大规模生产，能够为产业化生产带来巨大的实际应用价值。
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公开(公告)号：CN107988291A
公开(公告)日：2018-05-04
申请号：CN201810048908.8
申请日：2018-01-18
申请人： 江苏江山聚源生物技术有限公司
摘要： 本发明公开了一种毕赤酵母表达重组人源胶原蛋白的甲醇流加发酵工艺。所述工艺将毕赤酵母菌种液接种到灭菌的发酵培养基中，培养至甲醇流加诱导阶段，甲醇流加诱导的0～32h的前期阶段，甲醇流加速度为5.25±0.25L/h，33h～96h的中期阶段，甲醇流加速度为6.75±0.25L/h，97h～发酵结束的后期阶段，甲醇流加速度为5.25±0.25L/h。本发明将甲醇诱导阶段时改成分阶段恒速流加，可以保证毕赤酵母在不同代谢时期对碳源的需求。本发明工艺确定，可操作性强，易形成规范化文件，减少因技术失误而导致的产量下降，适合重组人源胶原蛋白的大规模工业化生产。
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公开(公告)号：CN106008702A
公开(公告)日：2016-10-12
申请号：CN201610585372.4
申请日：2016-07-22
申请人： 江苏江山聚源生物技术有限公司
摘要： 本发明公开了一种规模化分离纯化重组人源胶原蛋白的方法，通过将线性重组蛋白进行初折叠和重折叠，精确控制蛋白分子的空间半径，既有利于微滤和超滤膜孔径的精确选型，又可提高蛋白的回收率，联合应用微滤和超滤，分别去除大分子和小分子杂质，同时超滤实现蛋白浓缩，减轻了后期凝胶柱层析分离的负荷，再通过加入尿素，实现重组蛋白折叠后的解旋，避免了有害物的残留。本发明方法获得的重组人源胶原蛋白，纯度可达99％，回收率高于65％，方法操作简便，显著降低了重组人源胶原蛋白的规模化生产的成本，特别适合工业化生产。
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公开(公告)号：CN106256911B
公开(公告)日：2019-11-19
申请号：CN201610585373.9
申请日：2016-07-22
申请人： 江苏江山聚源生物技术有限公司
摘要： 本发明公开了一种适用于规模化生产重组人源胶原蛋白的毕赤酵母发酵培养基。本发明的培养基中添加了0.01～10g/L代谢调节剂，能够调节毕赤酵母的新陈代谢，加快重组蛋白的表达，缩短发酵周期，降低能耗，减少出错风险，保证稳定的工业化生产。使用本发明的培养基，在1000L发酵罐上规模化生产重组人源胶原蛋白，甲醇诱导周期缩短了20％，重组人源胶原蛋白的表达量提高了16.5％。本发明的毕赤酵母发酵培养基特别适用于工业化高密度发酵表达重组人源胶原蛋白的毕赤酵母甲醇诱导阶段，能够有效降低生产成本，产生显著的经济效益，对于重组人源胶原蛋白的工业化生产具有十分重要的实际意义。
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