公开(公告)号：CN117586902B

公开(公告)日：2024-07-26

申请号：CN202311603926.5

申请日：2023-11-28

Applicant: 江南大学

Inventor： 吕雪芹 ,  刘龙 ,  陈坚 ,  堵国成 ,  李江华 ,  刘延峰 ,  张智航

IPC: C12N1/19 ,  C07K14/52 ,  C07K19/00 ,  C12N15/81 ,  C12N15/67 ,  C12R1/84

Abstract: 本发明公开了一种高效分泌表达人骨桥蛋白的毕赤酵母及其构建和应用。首先通过构建杂合信号肽表达质粒引导OPN表达分泌，确定了一种能够有效的提高OPN的表达量的方法，摇瓶发酵产量为45.4mg/L；其次，对分子伴侣蛋白和转录因子进行筛选，在毕赤酵母中共表达，进行摇瓶发酵验证。取发酵液的上清液进行Western Blot和ELISA验证，发现胞外能够检测到OPN产量达到80.4mg/L，相较于原始菌株提升了2.5倍。本发明的毕赤酵母工程菌不仅解决了人骨桥蛋白在毕赤酵母中大量表达易出现错误折叠、引起细胞分泌系统崩溃的问题，促进了OPN在毕赤酵母中正确折叠并能够快速分泌到细胞外，还实现了目前OPN产量的最高水平，具有重大工业应用潜力。

公开(公告)号：CN113736815B

公开(公告)日：2022-05-24

申请号：CN202111035771.0

申请日：2021-09-06

Applicant: 江南大学

Inventor： 刘龙 ,  陈坚 ,  吕雪芹 ,  堵国成 ,  李江华 ,  刘延峰 ,  董雅君 ,  金柯 ,  张智航 ,  王凌锐

IPC: C12N15/75 ,  C12N1/21 ,  C12N15/31 ,  C12P7/66 ,  C12R1/125

Abstract: 本发明公开了一种通过强化枯草芽孢杆菌功能膜微域提高七烯甲萘醌产量的方法，本发明的方法是通过强化表达产七烯甲萘醌的枯草芽孢杆菌功能膜微域中的脚手架蛋白FloA。本发明通过对已高产MK‑7的重组枯草芽孢杆菌BS20中的脚手架蛋白使用强启动子P43进行强化，增加FMMs在细胞质膜上的占比后，进一步提高了MK‑7的产量，与对照菌株BS20相比，强化FloA的重组枯草芽孢杆菌BSQ1产量最高，发酵6天后，BSQ1菌株产量达到417.08mg/L，较BS20菌株提升了16.57％。

公开(公告)号：CN114606148A

公开(公告)日：2022-06-10

申请号：CN202210322609.5

申请日：2022-03-29

Applicant: 江南大学

Inventor： 刘龙 ,  陈坚 ,  吕雪芹 ,  堵国成 ,  李江华 ,  刘延峰 ,  张智航 ,  陶孟瑞 ,  孙丹

IPC: C12N1/19 ,  C12N15/81 ,  C12N15/62 ,  C12R1/84

Abstract: 本发明公开了一株表达骨桥蛋白的毕赤酵母菌株，属于基因工程领域。本发明在毕赤酵母基因组上AOX1位点成功整合包含PAOX1启动子、α信号肽和氨基酸序列如SEQ ID NO.1的骨桥蛋白的骨桥蛋白表达框。通过发酵实验发现，本发明提供的毕赤酵母基因工程菌株能够成功表达骨桥蛋白并部分分泌至胞外，但发酵后期蛋白分泌迟滞，大部分蛋白进入液泡。通过Western Blot验证和ELISA定量测定，确定本发明实现了骨桥蛋白的成功表达，且骨桥蛋白的表达量达到32.2mg/L。

公开(公告)号：CN117586902A

公开(公告)日：2024-02-23

申请号：CN202311603926.5

申请日：2023-11-28

Applicant: 江南大学

Inventor： 吕雪芹 ,  刘龙 ,  陈坚 ,  堵国成 ,  李江华 ,  刘延峰 ,  张智航

IPC: C12N1/19 ,  C07K14/52 ,  C07K19/00 ,  C12N15/81 ,  C12N15/67 ,  C12R1/84

Abstract: 本发明公开了一种高效分泌表达人骨桥蛋白的毕赤酵母及其构建和应用。首先通过构建杂合信号肽表达质粒引导OPN表达分泌，确定了一种能够有效的提高OPN的表达量的方法，摇瓶发酵产量为45.4mg/L；其次，对分子伴侣蛋白和转录因子进行筛选，在毕赤酵母中共表达，进行摇瓶发酵验证。取发酵液的上清液进行Western Blot和ELISA验证，发现胞外能够检测到OPN产量达到80.4mg/L，相较于原始菌株提升了2.5倍。本发明的毕赤酵母工程菌不仅解决了人骨桥蛋白在毕赤酵母中大量表达易出现错误折叠、引起细胞分泌系统崩溃的问题，促进了OPN在毕赤酵母中正确折叠并能够快速分泌到细胞外，还实现了目前OPN产量的最高水平，具有重大工业应用潜力。

公开(公告)号：CN116004701A

公开(公告)日：2023-04-25

申请号：CN202210957082.3

申请日：2022-08-10

Applicant: 江南大学 ,  白马未来食品研究院

Inventor： 刘龙 ,  陈坚 ,  吕雪芹 ,  堵国成 ,  李江华 ,  刘延峰 ,  张智航 ,  孙丹 ,  杨淇圆

IPC: C12N15/81 ,  C12N15/12 ,  C12N15/11 ,  C12N15/53 ,  C12N15/61 ,  C07K14/47 ,  C12N1/19 ,  C12R1/84

Abstract: 本发明涉及一种毕赤酵母及其构建方法与其在合成骨桥蛋白中的应用。本发明提供了骨桥蛋白表达系统，包括第一质粒和第二质粒；所述第一质粒上连接有编码骨桥蛋白的基因和分子信号肽，第二质粒上连接有编码分子伴侣蛋白的基因；所述骨桥蛋白表达系统用于毕赤酵母的构建，并以毕赤酵母X33为宿主，构建所得；所述分子伴侣蛋白选自PDI1基因、BIP基因、HAC1基因或ERO1基因中的一种或多种；所述信号肽选自α因子信号肽、OPN自身信号肽、INU1和MEL1中的一种或多种。本发明不仅能实现提高OPN表达量的目的，同时也提供了一种增加蛋白表达水平的方法。

公开(公告)号：CN113736815A

公开(公告)日：2021-12-03

申请号：CN202111035771.0

申请日：2021-09-06

Applicant: 江南大学

Inventor： 刘龙 ,  陈坚 ,  吕雪芹 ,  堵国成 ,  李江华 ,  刘延峰 ,  董雅君 ,  金柯 ,  张智航 ,  王凌锐

IPC: C12N15/75 ,  C12N1/21 ,  C12N15/31 ,  C12P7/66 ,  C12R1/125

Abstract: 本发明公开了一种通过强化枯草芽孢杆菌功能膜微域提高七烯甲萘醌产量的方法，本发明的方法是通过强化表达产七烯甲萘醌的枯草芽孢杆菌功能膜微域中的脚手架蛋白FloA。本发明通过对已高产MK‑7的重组枯草芽孢杆菌BS20中的脚手架蛋白使用强启动子P43进行强化，增加FMMs在细胞质膜上的占比后，进一步提高了MK‑7的产量，与对照菌株BS20相比，强化FloA的重组枯草芽孢杆菌BSQ1产量最高，发酵6天后，BSQ1菌株产量达到417.08mg/L，较BS20菌株提升了16.57％。