公开(公告)号：CN118222736A

公开(公告)日：2024-06-21

申请号：CN202410475798.9

申请日：2024-04-19

Applicant: 扬州大学

Inventor： 张臣臣 ,  胡梦灵 ,  孙月 ,  顾瑞霞 ,  邵俊 ,  陈大卫 ,  关成冉

IPC: C12Q1/689 ,  C12Q1/686 ,  C12N15/11

Abstract: 本发明公开了一种降低检测限的微生物或真核生物细胞定量检测方法。所述方法以提取的样品DNA为模板，先用目标微生物或目标真核生物细胞外侧引物对样品DNA进行15个循环的PCR扩增，将PCR产物作为模板，再用目标微生物或目标真核生物细胞特异性引物进行qPCR，将获得的Ct值代入标准曲线中，计算得到样品中目标微生物或目标真核生物细胞数量。本发明通过在特异性引物外侧加设一对引物，利用PCR方法对特异性片段区域进行分子富集，再利用特异性引物进行qPCR，能够将检测下限降低到原来的1%，有效提高了检测能力。

公开(公告)号：CN118581193A

公开(公告)日：2024-09-03

申请号：CN202410791226.1

申请日：2024-06-19

Applicant: 扬州大学

Inventor： 张臣臣 ,  孙月 ,  胡梦灵 ,  顾瑞霞 ,  邵俊 ,  陈大卫 ,  关成冉

IPC: C12Q1/6806 ,  C12Q1/6851 ,  C12N15/10

Abstract: 本发明公开了一种通过非特异性菌体提高细菌DNA提取均一度的方法，包括以下步骤：以非特异性菌为背景菌体，将含有非特异性菌的生理盐水加入含有原核生物细胞或真核生物细胞的待测样品中，离心收集菌体，提取菌体DNA，进行qPCR即可；所述非特异性菌与目标菌种细胞壁结构相似、DNA与目标菌种特异性引物无扩增反应。本发明方法将可检测到的菌体DNA浓度下限降低至原来的1％。本发明方法实现了乳杆菌(鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌)和双歧杆菌(长双歧杆菌、动物双歧杆菌)DNA提取的均一化，能够更好地识别、鉴定和计数样本中存在的细菌/微生物/真核生物细胞，可应用于分析母乳等稀有品，提高分析准确性。

公开(公告)号：CN119162354A

公开(公告)日：2024-12-20

申请号：CN202411405722.5

申请日：2024-10-10

Applicant: 扬州大学

Inventor： 张臣臣 ,  孙月 ,  胡梦灵 ,  顾瑞霞 ,  邵俊 ,  吴忧 ,  陈大卫 ,  关成冉

IPC: C12Q1/689 ,  C12Q1/6851 ,  C12N15/11 ,  C12R1/225

Abstract: 本发明公开一种乳酸菌基因完全敲除缺陷型的选择计数方法，设计待计数菌体基因敲除区域嵌套引物，以待计数菌体基因敲除缺陷型的DNA为模板扩增特异性片段，构建缺陷型菌株计数载体，绘制缺陷型菌株标准曲线；在缺陷型缺失基因内设计野生型计数引物，构建野生型菌株区分专用载体，绘制野生型菌株标准曲线；提取待计数菌体基因组DNA，控制退火延伸时间，采用敲除区域嵌套引物进行两步法qPCR扩增，对待计数菌体的完全敲除缺陷型进行计数。本发明能够对野生型及缺陷型进行区分，达到定量计数的目的，以分析样品中基因工程菌的变化规律，进而更好地分析目的基因在生物进化、合成菌落和食品生产中的作用，为食品的精准设计和开发提供技术支持。