公开(公告)号：CN108285906A

公开(公告)日：2018-07-17

申请号：CN201711477805.5

申请日：2017-12-29

申请人： 广东温氏食品集团股份有限公司 ,  华南农业大学

发明人： 吴珍芳 ,  张献伟 ,  李国玲 ,  杨化强 ,  莫健新 ,  钟翠丽 ,  石俊松 ,  贺晓燕 ,  张健 ,  李紫聪 ,  蔡更元

IPC分类号： C12N15/85 ,  C12N5/10 ,  A01K67/027

CPC分类号： C12N15/85 ,  A01K67/0275 ,  A01K2227/108 ,  A01K2267/02

摘要： 本发明公开了一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法，包括以下步骤：S1、安全靶点筛选及靶点绑定gRNA切割效率验证；S2、构建同源臂供体质粒，并获得定点整合转基因细胞系；S3、外源DNA定点整合转基因猪的构建。本发明在供体质粒中引入gRNA靶点序列，利用细胞内转录gRNA诱导Cas9核酸酶切割靶基因同时，线性化供体质粒，大大简化试验步骤，节约人力，且有利于提高共转染效率。本发明定点整合所用载体较少，同源臂大小适中，更有利于获得转基因细胞系，将高效定点整合技术，高活力定点转基因细胞培育技术与体细胞克隆技术结合，有利于定点整合转基因动物高效制备，加快转基因动物新品种培育速度。

公开(公告)号：CN105039305A

公开(公告)日：2015-11-11

申请号：CN201510388055.9

申请日：2015-07-06

申请人： 广东温氏食品集团股份有限公司

发明人： 吴珍芳 ,  周荣 ,  石俊松 ,  麦然标 ,  余婉娴

IPC分类号： C12N15/06

摘要： 本发明涉及克隆技术领域，具体公开了一种克隆胚胎构建的改进方法。所述方法包含如下步骤：S1.将卵母细胞置于操作液滴A中，利用盲吸法完成去核操作；S2.将去除细胞核的胞质部分置于染色液滴中，直接在荧光镜下观察胞质的着色情况，然后将对应的去核干净的卵母细胞备用；S3.将去核干净的卵母细胞放入操作液滴B中静置，然后移放到含有供体细胞的操作液滴C中，先将一枚卵母细胞与一枚供体细胞粘合，然后再与另一枚卵母细胞粘合在一起，其排列顺序为体细胞一卵细胞一卵细胞；S4.将粘合好的体细胞一卵细胞一卵细胞先在融合激活液中静置，再移到融合槽中进行电融合。该方法具有操作简洁迅速、去核干净且效率高、克隆效率高等优点。

公开(公告)号：CN104946581A

公开(公告)日：2015-09-30

申请号：CN201510210334.6

申请日：2015-04-28

申请人： 广东温氏食品集团股份有限公司 ,  华南农业大学

发明人： 吴珍芳 ,  贺晓燕 ,  孟繁明 ,  李紫聪 ,  石俊松 ,  周荣 ,  张献伟

IPC分类号： C12N5/0735

摘要： 本发明公开了一种培养猪滋养层干细胞的专用培养基及方法，该专用培养基成分包括bFGF、activin A、Y27632、Knockout SR和β-巯基乙醇 。培养方法是将干细胞培养器皿预先用细胞外基质包被；然后将猪囊胚用蛋白酶消化去除透明带，转入干细胞培养器皿中，添加本发明的专用培养基；培养至形成总细胞数为1000~2000个的滋养层干细胞克隆团时，消化成单细胞，转入新的经细胞外基质包被的培养器皿进行细胞的传代培养。本发明的专用培养基成分确定，使用安全性高，避免异源细胞的污染。培养方法简单高效，对猪滋养层干细胞培养具有克隆形成率高、细胞凋亡率低、增殖传代能力强和安全稳定的优点。

公开(公告)号：CN104651407A

公开(公告)日：2015-05-27

申请号：CN201510067003.1

申请日：2015-02-06

申请人： 广东温氏食品集团股份有限公司

发明人： 吴珍芳 ,  石俊松 ,  罗绿花 ,  周荣 ,  纪红美 ,  蔡更元 ,  贺晓燕

IPC分类号： C12N15/877

摘要： 本发明公开了一种猪克隆胚胎的高效制备方法，在成熟的去核猪卵母细胞中注入供体细胞，在无钙融合液中，电刺激使供体细胞融合到去核卵母细胞内，培养1-1.5h；挑出已融合的胚胎，放入钙离子浓度为0.1mmol/L的激活液内，电刺激激活胚胎，即得猪克隆胚胎。本发明先将供体细胞融合到去核猪卵母细胞中并培养1-1.5h，这样在激活前，供体细胞核充分暴露在卵子胞质里，会使染色质长时间凝聚，促进核的重编程，有利于胚胎的激活和发育，从而会显著提高克隆猪生产效率。该方法与常规的融合激活同步方法相比，融合率差异不显著，但本方法克隆胚胎移植到受体猪后，克隆猪的生产效率大大高于常规方法。

公开(公告)号：CN104073465A

公开(公告)日：2014-10-01

申请号：CN201410314294.5

申请日：2014-07-04

申请人： 广东温氏食品集团股份有限公司

发明人： 吴珍芳 ,  石俊松 ,  麦然标 ,  余婉娴 ,  周荣 ,  罗绿花

IPC分类号： C12N5/075

摘要： 一种卵母细胞长距离运输方法，包括以下步骤：S1.在与待运输卵母细胞相应的培养液液中添加10体积%相应的卵泡液，到得成熟培养液；S2.将成熟的培养液分装至离心管中，离心管管口敞开；S3.将装有成熟液的离心管放入含有5%体积的CO2和最大饱和湿度的培养箱内平衡，培养箱内的温度根据待运输的卵母细胞确定；S4.并将收集到的卵母细胞放入平衡后的离心管中再平衡1小时，然后用盖子密封；S5.将密封后离心管放入38.5℃的恒温箱内运输即可。本发明通过培养液中溶入大量的二氧化碳气体，并采用密封的方式防止气体泄漏，来满足长距离运输中所需要的二氧化碳浓度，从而来维持卵母细胞培养过程的所需压强和pH，保证卵母细胞在运输过程中正常的成熟发育。

公开(公告)号：CN102943093A

公开(公告)日：2013-02-27

申请号：CN201210474265.6

申请日：2012-11-20

申请人： 广东温氏食品集团股份有限公司

发明人： 吴珍芳 ,  贺晓燕 ,  许卫华 ,  石俊松 ,  周荣

IPC分类号： C12N15/877

摘要： 本发明公开了一种提高猪体细胞核移植效率的方法，包括以下步骤：S1、选择和培养卵母细胞；S2、分离和培养供体细胞；S3、采用盲吸法去除成熟卵母细胞核及第一极体，注入一个供体细胞于卵周隙中；电融合重构胚并激活重构胚；S4、将重构胚置于含有浓度为100-200μM的RG108和浓度为100-500nM的Scriptaid的PZM-3培养液中培养14-16小时，再将重构胚置于PZM-3培养液中培养；本发明能显著提高猪克隆早期胚胎的发育囊胚率和囊胚质量；同时调节存在紧密联系和协同作用的基因甲基化和乙酰化两大表观遗传修饰，比单独用Scriptaid处理的效果更好，能调节胚胎早期基因表达趋于正常，最终提高猪体细胞核移植效率。

公开(公告)号：CN108913663A

公开(公告)日：2018-11-30

申请号：CN201810561797.0

申请日：2018-06-04

申请人： 广东温氏食品集团股份有限公司

发明人： 吴珍芳 ,  石俊松 ,  许卫华 ,  周荣 ,  罗绿花 ,  麦然标 ,  蔡更元

IPC分类号： C12N5/10

摘要： 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高核移植胚胎体外发育效率的方法。本发明提供的提高核移植胚胎体外发育效率的方法，包括：将激活后的核移植重构胚，转入含BET蛋白抑制剂(+)-JQ1的胚胎培养液中培养。本发明方法可以抑制细胞定向转录记忆，促进了核移植胚胎重编程，从而提高体细胞核移植胚胎的体外发育效率。

公开(公告)号：CN105039305B

公开(公告)日：2018-04-10

申请号：CN201510388055.9

申请日：2015-07-06

申请人： 广东温氏食品集团股份有限公司

发明人： 吴珍芳 ,  周荣 ,  石俊松 ,  麦然标 ,  余婉娴

IPC分类号： C12N15/06

摘要： 本发明涉及克隆技术领域，具体公开了一种克隆胚胎构建的改进方法。所述方法包含如下步骤：S1.将卵母细胞置于操作液滴A中，利用盲吸法完成去核操作；S2.将去除细胞核的胞质部分置于染色液滴中，直接在荧光镜下观察胞质的着色情况，然后将对应的去核干净的卵母细胞备用；S3.将去核干净的卵母细胞放入操作液滴B中静置，然后移放到含有供体细胞的操作液滴C中，先将一枚卵母细胞与一枚供体细胞粘合，然后再与另一枚卵母细胞粘合在一起，其排列顺序为体细胞一卵细胞一卵细胞；S4.将粘合好的体细胞一卵细胞一卵细胞先在融合激活液中静置，再移到融合槽中进行电融合。该方法具有操作简洁迅速、去核干净且效率高、克隆效率高等优点。

公开(公告)号：CN106086068A

公开(公告)日：2016-11-09

申请号：CN201610397567.6

申请日：2016-06-06

申请人： 广东温氏食品集团股份有限公司 ,  华南农业大学

发明人： 吴珍芳 ,  张献伟 ,  孙悦 ,  钟翠丽 ,  李国玲 ,  李紫聪 ,  蔡更元 ,  石俊松

IPC分类号： C12N15/85 ,  C12N15/56 ,  C12N15/60 ,  C12N15/66

摘要： 本发明公开了一种多顺反子、唾液腺特异性表达该多顺反子的载体及其构建方法，所述多基因共表达的多顺反子具有如SEQ ID No:1所示的碱基序列，所述唾液腺特异性表达多顺反子的载体具有如SEQ ID No:3所示的核苷酸序列，其是以多顺反子真核表达载体pCD‑PXAT和pPB‑mPSP‑neoGFP载体为原料构建得到的。本发明构建的多顺反子能共表达纤维素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果胶酶与植酸酶，囊括了常规饲料中NSP酶的所有主要成员和植酸酶，这些酶都能较好的兼容动物胃肠消化道pH环境，具有较好的胃蛋白和胰蛋白酶耐受性，且始终保持较高的活性，克服了传统饲料用酶制剂在加工，生产使用中缺陷和问题，由于是动物自身分泌，几乎不存在成本问题。

公开(公告)号：CN103937746A

公开(公告)日：2014-07-23

申请号：CN201410097949.8

申请日：2014-03-18

申请人： 广东温氏食品集团股份有限公司

发明人： 吴珍芳 ,  贺晓燕 ,  张献伟 ,  李紫聪 ,  刘德武 ,  石俊松 ,  周荣

IPC分类号： C12N5/10 ,  C12N15/87 ,  C12N5/073

摘要： 本发明公开了一种制备动物转基因阳性单细胞克隆的方法，步骤为：（1）构建包括目的基因、荧光标记基因和药物筛选标记基因的质粒；（2）质粒转染已培养至对数生长期的宿主动物细胞；（3）经转染的细胞生长恢复后，进行消化、离心和重悬稀释，再置于荧光显微镜下，用内径20~80μm的吸针吸取表达荧光标记基因的单个细胞，分别接种至不同份的细胞培养基中；（4）各单个细胞生长成克隆团后，消化其中稳定表达荧光标记基因的细胞克隆团进行传代扩增，即得到转基因阳性单细胞的克隆。该方法转基因阳性单个细胞分离和接种技术操作简单快速、克隆形成率高，大大简化了不同转基因动物个体的检测鉴定工作，降低检测成本，省时省力。