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公开(公告)号：CN101157934B
公开(公告)日：2011-08-31
申请号：CN200710046172.2
申请日：2007-09-20
Applicant: 复旦大学
Abstract: 本发明属生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种基于Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶的基因克隆质粒(pBCFX+和pBCFX-)及其应用。该质粒使用含有Phi BT1整合酶及PhiC整合酶对应attP位点串连序列的中间插入LacZ表达框架作为质粒载体(pBCFX+和pBCFX-)置换克隆位点，采用插入失活作蓝白筛选。基于该质粒的克隆方法主要包括使用Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶混合物作为定点整合催化酶，插入DNA片段依据目的要求可以通过PCR等技术在两侧附加对应的attB序列，从而决定插入片段方向性。该克隆系可以方便操作含有特别内切酶位点的插入DNA，在大片段基因操作方面有独到优因为该体系不需要限制性酶，磷酸酶和连接酶操作，可以简化重组DNA操作方法。基因工程中有广泛应用前景。
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公开(公告)号：CN101157934A
公开(公告)日：2008-04-09
申请号：CN200710046172.2
申请日：2007-09-20
Applicant: 复旦大学
Abstract: 本发明属生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种基于Phi BT1整合酶及Phi C31整合酶的基因克隆质粒(pBCFX+和pBCFX－)及其应用。该质粒使用含有Phi BT1整合酶及PhiC31整合酶对应attP位点串连序列的中间插入LacZ表达框架作为质粒载体(pBCFX+和pBCFX－)置换克隆位点，采用插入失活作蓝白筛选。基于该质粒的克隆方法主要包括使用PhiBT1整合酶及Phi C31整合酶混合物作为定点整合催化酶，插入DNA片段依据目的要求可以通过PCR等技术在两侧附加对应的attB序列，从而决定插入片段方向性。该克隆体系可以方便操作含有特别内切酶位点的插入DNA，在大片段基因操作方面有独到优势，因为该体系不需要限制性酶，磷酸酶和连接酶操作，可以简化重组DNA操作方法。在基因工程中有广泛应用前景。
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公开(公告)号：CN101157919A
公开(公告)日：2008-04-09
申请号：CN200710046169.0
申请日：2007-09-20
Applicant: 复旦大学
Abstract: 本发明属生物技术和基因治疗技术领域，具体为一种用于哺乳动物细胞内反式提供rep蛋白的表达质粒。该表达质粒具有负反馈调节机制，即在rep达到一定水平后反馈关闭rep蛋白的表达，并且该质粒有自身不整合到宿主基因组的特性。该质粒的特性源于对AAV病毒P5启动子的RBE的定向突变，使其在细胞内可以如野生P5启动子一样具有负反馈作用，但是不像野生P5一样具有整合到基因组的能力，一方面保证rep适度表达，避免rep短期细胞毒性，同时防止自身整合到基因组，提高长期遗传安全性。该质粒可以广泛用于需要适度反式提供rep蛋白的基因操作和基因治疗体系，如AAV病毒包装体系和依赖RBE介导的基因定点整合操作与基因治疗。
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公开(公告)号：CN101157906A
公开(公告)日：2008-04-09
申请号：CN200710046170.3
申请日：2007-09-20
Applicant: 复旦大学
Abstract: 本发明属生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种用于定点整合的蛋白酶Phi BT1－TAT－NLS－HIS6整合酶及其制备方法，其多克隆抗体及其应用。首先表达纯化Phi BT1－TAT－NLS－HIS6整合酶蛋白质，该蛋白质保持PhiBT1整合酶的基本特性，但是其可以通过蛋白转导进入高等生物细胞，并增加蛋白向细胞核转移的能力，同时适用于细胞外体系以及活细胞体系中介导特异性附加在attP与attB上的DNA分子之间的交换与转移等基因操作。用Phi BT1－TAT－NLS－HIS6整合酶蛋白质直接与佐剂相混合，注射免疫动物，制得Phi BT1整合酶多克隆抗体。该抗体可以用于特异性识别Phi BT1整合酶蛋白质。
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