公开(公告)号：CN103849640A

公开(公告)日：2014-06-11

申请号：CN201410089063.9

申请日：2014-03-12

Applicant: 南京师范大学

Inventor： 尚广东 ,  骆希 ,  张青 ,  杨晨 ,  花月

IPC: C12N15/70

Abstract: 本发明涉及一种利用寡核苷酸和可消除的质粒共转化对大肠杆菌基因组上的必需基因进行点突变的方法。具体为将前面四个碱基以硫磷酰基连接的、长度为91个碱基、中间为突变位点的寡核苷酸和可消除的质粒共转化表达重组酶的大肠杆菌。可消除的质粒含50bp与lacZ基因的同源序列、氨苄青霉素抗性基因、I-SceI基因、两个I-SceI酶切位点和R6K复制子。在由重组酶催化而与基因组50bp？lacZ同源片段整合而表现氨苄青霉素抗性的菌株中，筛选点突变的菌株。整合型菌株可通过热失活的氯四环素作用，诱导表达I-SceI，I-SceI作用于其酶切位点，通过两个50bp？lacZ片段之间的同源重组而去除可消除的质粒。

公开(公告)号：CN103849640B

公开(公告)日：2016-01-20

申请号：CN201410089063.9

申请日：2014-03-12

Applicant: 南京师范大学

Inventor： 尚广东 ,  骆希 ,  张青 ,  杨晨 ,  花月

IPC: C12N15/70

Abstract: 本发明涉及一种利用寡核苷酸和可消除的质粒共转化对大肠杆菌基因组上的必需基因进行点突变的方法。具体为将前面四个碱基以硫磷酰基连接的、长度为91个碱基、中间为突变位点的寡核苷酸和可消除的质粒共转化表达重组酶的大肠杆菌。可消除的质粒含50bp与lacZ基因的同源序列、氨苄青霉素抗性基因、I-SceI基因、两个I-SceI酶切位点和R6K复制子。在由重组酶催化而与基因组50bp lacZ同源片段整合而表现氨苄青霉素抗性的菌株中，筛选点突变的菌株。整合型菌株可通过热失活的氯四环素作用，诱导表达I-SceI，I-SceI作用于其酶切位点，通过两个50bp lacZ片段之间的同源重组而去除可消除的质粒。