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公开(公告)号：CN103849640A
公开(公告)日：2014-06-11
申请号：CN201410089063.9
申请日：2014-03-12
Applicant: 南京师范大学
IPC: C12N15/70
Abstract: 本发明涉及一种利用寡核苷酸和可消除的质粒共转化对大肠杆菌基因组上的必需基因进行点突变的方法。具体为将前面四个碱基以硫磷酰基连接的、长度为91个碱基、中间为突变位点的寡核苷酸和可消除的质粒共转化表达重组酶的大肠杆菌。可消除的质粒含50bp与lacZ基因的同源序列、氨苄青霉素抗性基因、I-SceI基因、两个I-SceI酶切位点和R6K复制子。在由重组酶催化而与基因组50bp？lacZ同源片段整合而表现氨苄青霉素抗性的菌株中，筛选点突变的菌株。整合型菌株可通过热失活的氯四环素作用，诱导表达I-SceI，I-SceI作用于其酶切位点，通过两个50bp？lacZ片段之间的同源重组而去除可消除的质粒。
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公开(公告)号：CN103849640B
公开(公告)日：2016-01-20
申请号：CN201410089063.9
申请日：2014-03-12
Applicant: 南京师范大学
IPC: C12N15/70
Abstract: 本发明涉及一种利用寡核苷酸和可消除的质粒共转化对大肠杆菌基因组上的必需基因进行点突变的方法。具体为将前面四个碱基以硫磷酰基连接的、长度为91个碱基、中间为突变位点的寡核苷酸和可消除的质粒共转化表达重组酶的大肠杆菌。可消除的质粒含50bp与lacZ基因的同源序列、氨苄青霉素抗性基因、I-SceI基因、两个I-SceI酶切位点和R6K复制子。在由重组酶催化而与基因组50bp lacZ同源片段整合而表现氨苄青霉素抗性的菌株中，筛选点突变的菌株。整合型菌株可通过热失活的氯四环素作用，诱导表达I-SceI，I-SceI作用于其酶切位点，通过两个50bp lacZ片段之间的同源重组而去除可消除的质粒。
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公开(公告)号：CN103667331B
公开(公告)日：2015-09-30
申请号：CN201310669870.3
申请日：2013-12-10
Applicant: 南京师范大学
IPC: C12N15/70
Abstract: 本发明涉及一种将来源于lambda噬菌体的重组酶基因bet作为融合标签的方法。本方法是将来源于lambda噬菌体的重组酶基因bet作为融合标签。将六个组氨酸、bet基因、TEV酶切位点和一段填充片段等元件的核苷酸序列克隆至大肠杆菌表达载体pET30a(+)，获得bet基因融合表达载体。待表达的目的基因可通过取代填充片段而与六个组氨酸标签和bet基因在读码框内融合，在大肠杆菌中经诱导而表达获得标签蛋白和目的蛋白相融合的蛋白。融合表达可大大地提高目的蛋白的可溶性组份比例。
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公开(公告)号：CN103993030A
公开(公告)日：2014-08-20
申请号：CN201410232934.8
申请日：2014-05-28
Applicant: 南京师范大学
Abstract: 本发明涉及一种大肠杆菌细胞内蛋白酶剪切融合蛋白以分离目的蛋白的方法。所使用的宿主菌为通过重组工程方法将强启动子T7驱动的TEV蛋白酶基因整合至大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)而获得。表达载体为将麦芽糖结合蛋白和填充片段克隆至表达载体pET30(+)而获得。将不含终止子目的基因取代填充片段而获得目的基因融合表达载体，融合蛋白的末端含载体的6个组氨酸。表达载体转化至宿主菌后，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导之下，同时表达融合蛋白和基于染色体的TEV蛋白酶，TEV作用于麦芽糖结合蛋白和目的蛋白之间的酶切位点而将目的蛋白分离。此细胞内剪切方法省略了融合蛋白分离和TEV酶切等步骤。
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公开(公告)号：CN103667331A
公开(公告)日：2014-03-26
申请号：CN201310669870.3
申请日：2013-12-10
Applicant: 南京师范大学
IPC: C12N15/70
Abstract: 本发明涉及一种将来源于lambda噬菌体的重组酶基因bet作为融合标签的方法。本方法是将来源于lambda噬菌体的重组酶基因bet作为融合标签。将六个组氨酸、bet基因、TEV酶切位点和一段填充片段等元件的核苷酸序列克隆至大肠杆菌表达载体pET30a(+)，获得bet基因融合表达载体。待表达的目的基因可通过取代填充片段而与六个组氨酸标签和bet基因在读码框内融合，在大肠杆菌中经诱导而表达获得标签蛋白和目的蛋白相融合的蛋白。融合表达可大大地提高目的蛋白的可溶性组份比例。
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公开(公告)号：CN105238820A
公开(公告)日：2016-01-13
申请号：CN201510760227.0
申请日：2015-11-10
Applicant: 南京师范大学
Abstract: 本发明涉及一种用于大肠杆菌基因敲入的负筛选标记，即plac启动子驱动的毒性基因ccdB。plac-ccdB和庆大霉素抗性基因aacC1组成用于基因敲入的基因盒。第一步扩增得到含同源臂plac-ccdB-aacC1的DNA片段，电转化至表达重组酶的大肠杆菌。在庆大霉素筛选之下，重组酶催化同源重组而将此DNA片段整合至大肠杆菌基因组。第二步利用相同的同源臂扩增外源DNA片段，电转化表达重组酶的第一步所得菌株，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷筛选之下，ccdB表达，其毒性作为负筛选标记的特征，重组酶催化同源臂之间的同源重组，外源DNA片段取代plac-ccdB-aacC1基因盒而实现基因敲入。
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