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公开(公告)号：CN103849640A
公开(公告)日：2014-06-11
申请号：CN201410089063.9
申请日：2014-03-12
Applicant: 南京师范大学
IPC: C12N15/70
Abstract: 本发明涉及一种利用寡核苷酸和可消除的质粒共转化对大肠杆菌基因组上的必需基因进行点突变的方法。具体为将前面四个碱基以硫磷酰基连接的、长度为91个碱基、中间为突变位点的寡核苷酸和可消除的质粒共转化表达重组酶的大肠杆菌。可消除的质粒含50bp与lacZ基因的同源序列、氨苄青霉素抗性基因、I-SceI基因、两个I-SceI酶切位点和R6K复制子。在由重组酶催化而与基因组50bp？lacZ同源片段整合而表现氨苄青霉素抗性的菌株中，筛选点突变的菌株。整合型菌株可通过热失活的氯四环素作用，诱导表达I-SceI，I-SceI作用于其酶切位点，通过两个50bp？lacZ片段之间的同源重组而去除可消除的质粒。
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公开(公告)号：CN101597618B
公开(公告)日：2012-05-02
申请号：CN200910032461.6
申请日：2009-07-08
Applicant: 南京师范大学
Abstract: 本发明涉及恶臭假单胞菌KT2440(Pseudomonasputida KT2440)高效电转化方法。该方法是：以EM培养基，30℃培养菌体至OD600为0.6-0.75，3mM 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES，pH＝7.0)缓冲液洗涤并悬浮菌体，电转化条件：1.2kV，200Ω，25μF；电转化后加1ml SOC培养基，在15ml聚丙烯离心管中，30℃培养2h。利用本发明的方法转化效率可达3.0×108/μg，比现有技术效率高出30倍左右。高效的电转化效率可以保证外源基因高效的转化至菌株；保证大分子量质粒DNA也可以高效电转化；在需要高效率转化时，如随机文库的转化时尤为关键。本发明也可为高效转化其它假单胞杆菌提供借鉴。
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公开(公告)号：CN104046647A
公开(公告)日：2014-09-17
申请号：CN201410295367.0
申请日：2014-06-26
Applicant: 南京师范大学
Abstract: 本发明涉及一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法。具体实施步骤为首先通过重叠－延伸聚合酶链式反应扩增获得两侧为针对待敲除基因的约500bp同源片段、中间为卡那霉素抗性基因的融合DNA片段。其次将此DNA片段电转化至异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组酶表达的Rm1021细胞中，在卡那霉素抗性筛选之下，卡那霉素抗性基因取代目的基因而获得基因敲除变株。最后将菌株在含0.4％蔗糖的固体培养基中培养以消除含重组酶基因的质粒。所使用的重组酶基因来源于λ噬菌体并克隆在质粒pLS2406之上，pLS2406同时含有负筛选标记sacB基因。
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公开(公告)号：CN103667331A
公开(公告)日：2014-03-26
申请号：CN201310669870.3
申请日：2013-12-10
Applicant: 南京师范大学
IPC: C12N15/70
Abstract: 本发明涉及一种将来源于lambda噬菌体的重组酶基因bet作为融合标签的方法。本方法是将来源于lambda噬菌体的重组酶基因bet作为融合标签。将六个组氨酸、bet基因、TEV酶切位点和一段填充片段等元件的核苷酸序列克隆至大肠杆菌表达载体pET30a(+)，获得bet基因融合表达载体。待表达的目的基因可通过取代填充片段而与六个组氨酸标签和bet基因在读码框内融合，在大肠杆菌中经诱导而表达获得标签蛋白和目的蛋白相融合的蛋白。融合表达可大大地提高目的蛋白的可溶性组份比例。
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公开(公告)号：CN102876623A
公开(公告)日：2013-01-16
申请号：CN201210378139.0
申请日：2012-09-29
Applicant: 南京师范大学
Abstract: 本发明涉及一种基于重组工程的定点突变的方法。本方法是先通过重叠－延伸聚合酶链式反应获得一个含有与克隆在质粒上的待突变靶位点上游50bp序列一致的左端50bp同源臂、突变位点、靶基因突变位点的下游片段、与质粒所含的抗性基因不同的另外一个抗性基因和载体所含的抗性基因下游的50bp右端同源臂的一个DNA修饰片段。随后将此融合片段电转化表达重组酶的、含有克隆有靶基因的质粒的大肠杆菌中，通过重组酶介导的同源重组，直接获得靶位点发生定点突变以及原质粒上的抗性基因被修饰片段做携带的抗性基因所取代的重组克隆。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN101921800B
公开(公告)日：2012-07-04
申请号：CN201010195054.X
申请日：2010-06-08
Applicant: 南京师范大学
Abstract: 本发明涉及一种将来源自大肠杆菌的启动因子(trigger factor)作为融合标签来使用的大肠杆菌蛋白表达载体pLS1128。该载体是通过将编码六个组氨酸的核苷酸序列、启动因子基因、编码烟草蚀纹病毒蛋白酶的切割位点的碱基序列以及一段用来克隆使用的填充片段克隆至大肠杆菌表达载体pET30a而得到。通过基因克隆手段，将目的基因克隆在启动因子基因下游后，两者经诱导而表达融合蛋白，启动因子行使伴侣蛋白的功能，促使目的蛋白正确的折叠而使之呈现可溶性的状态。本发明所述的载体可广泛运用与目的基因的表达和提高目的蛋白的可溶性，可在遗传学、分子生物学、生物化学等研究及工业化生产目的蛋白方面有着广泛应用。
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公开(公告)号：CN102071185A
公开(公告)日：2011-05-25
申请号：CN201010575202.0
申请日：2010-12-06
Applicant: 南京师范大学
Abstract: 本发明涉及一种通过重组工程手段对恶臭假单胞菌KT2440进行基因敲除的方法。具体方法是首先通过重叠－延伸聚合酶链式反应的手段扩增而获得左右两侧分别为待敲除的靶基因上下游各约500个碱基对的同源基因，中间为卡那霉素抗性基因的DNA片段。再将此DNA片段电转化至以终浓度为2mM间甲基苯甲酸诱导重组酶表达的恶臭假单胞菌KT2440电转化感受态细胞中，通过重组酶介导的同源片段之间的同源重组，卡那霉素抗性基因取代了靶基因而直接获得了靶基因敲除的突变株。本发明所述方法简便快捷，可成为在生物降解有机化合物等方面有着重要应用价值的环境微生物恶臭假单胞菌KT2440的遗传操作手段。
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公开(公告)号：CN101696416A
公开(公告)日：2010-04-21
申请号：CN200910206273.0
申请日：2009-10-16
Applicant: 南京师范大学
Abstract: 本发明涉及一个rpsL基因和多克隆位点序列融合的新型克隆载体pLS975。该载体是首先通过重叠延伸PCR手段将一个多克隆位点序列插入至rpsL基因的启动子和开放阅读框之间，再将此DNA片段克隆至去除了多克隆位点序列的高拷贝质粒pBluescript KS(-)而获得。在pLS975中，多克隆位点序列和rpsL基因是在读码框内融合，此融合基因保留了rpsL基因的负筛选标记的功能。pLS975为高拷贝的氨苄青霉素抗性载体，共有18个酶切位点可用于外源DNA片段的克隆，以氨苄青霉素抗性和和1mg/ml的链霉素进行重组克隆的筛选。以本载体进行基因克隆操作简便，重组效率高(96％～100％)，可成为通用的克隆载体。
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公开(公告)号：CN105238820A
公开(公告)日：2016-01-13
申请号：CN201510760227.0
申请日：2015-11-10
Applicant: 南京师范大学
Abstract: 本发明涉及一种用于大肠杆菌基因敲入的负筛选标记，即plac启动子驱动的毒性基因ccdB。plac-ccdB和庆大霉素抗性基因aacC1组成用于基因敲入的基因盒。第一步扩增得到含同源臂plac-ccdB-aacC1的DNA片段，电转化至表达重组酶的大肠杆菌。在庆大霉素筛选之下，重组酶催化同源重组而将此DNA片段整合至大肠杆菌基因组。第二步利用相同的同源臂扩增外源DNA片段，电转化表达重组酶的第一步所得菌株，在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷筛选之下，ccdB表达，其毒性作为负筛选标记的特征，重组酶催化同源臂之间的同源重组，外源DNA片段取代plac-ccdB-aacC1基因盒而实现基因敲入。
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公开(公告)号：CN101302531B
公开(公告)日：2011-05-18
申请号：CN200810122910.1
申请日：2008-06-20
Applicant: 南京师范大学
Abstract: 本发明涉及在大肠杆菌-链霉菌-假单胞菌之间穿梭表达的BAC载体及其构建方法。所说的BAC载体，其含有pUC18的复制子，氨苄青霉素抗性基因，接合转移片段oriT，attP位点，整合酶基因int，Am抗性基因，假单胞菌的PP_0423′基因的5′端，假单胞菌的crp基因，BAC载体的redF基因、复制区OriS、repA基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、cos位点和loxP位点。本发明是从pECBAC1出发，将异源表达的必需原件加以有效综合和优化，并运用基因克隆和重组工程等手段，成功构建了穿梭表达BAC载体，为异源表达生物合成基因蔟以及高通量筛选方面提供了方便。
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