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公开(公告)号：CN106399371B
公开(公告)日：2019-07-26
申请号：CN201610823307.0
申请日：2016-09-14
Applicant: 湖南农业大学
IPC: C12N15/85 , A01K67/027
Abstract: 本发明提供了一种构建基因替代小鼠研究野生型和突变体非肌性肌球蛋白重链II功能的方法。本发明改造的mpNTKV‑LoxP载体更适合于构建基因打靶载体特别是基因替代目的，新加入的Pac I和Swa I都是识别八个碱基的限制性内切酶，有利于较大DNA片段的插入。构建的MYH9基因替代(即内源MYH9基因被外源编码非肌性肌球蛋白重链II基因所替代)打靶载体通过电转导入小鼠ES细胞中，经过药物筛选，ES细胞单克隆挑选，Southern Blot或PCR鉴定，发生同源重组的阳性单克隆细胞率高达90％以上，易于获得所需细胞系。使用阳性ES细胞显微注射至小鼠囊胚获得MYH9基因替代嵌合体小鼠，并且该嵌合体小鼠可以交配传代，从而获得MYH9基因替代杂合子及纯合子后代。
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公开(公告)号：CN106399371A
公开(公告)日：2017-02-15
申请号：CN201610823307.0
申请日：2016-09-14
Applicant: 湖南农业大学
IPC: C12N15/85 , A01K67/027
CPC classification number: C12N15/8509 , A01K2217/05 , A01K2227/105 , A01K2267/03
Abstract: 本发明提供了一种构建基因替代小鼠研究野生型和突变体非肌性肌球蛋白重链II功能的方法。本发明改造的mpNTKV-LoxP载体更适合于构建基因打靶载体特别是基因替代目的，新加入的Pac I和Swa I都是识别八个碱基的限制性内切酶，有利于较大DNA片段的插入。构建的MYH9基因替代(即内源MYH9基因被外源编码非肌性肌球蛋白重链II基因所替代)打靶载体通过电转导入小鼠ES细胞中，经过药物筛选，ES细胞单克隆挑选，Southern Blot或PCR鉴定，发生同源重组的阳性单克隆细胞率高达90％以上，易于获得所需细胞系。使用阳性ES细胞显微注射至小鼠囊胚获得MYH9基因替代嵌合体小鼠，并且该嵌合体小鼠可以交配传代，从而获得MYH9基因替代杂合子及纯合子后代。
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公开(公告)号：CN108410907B
公开(公告)日：2021-08-27
申请号：CN201810192797.8
申请日：2018-03-08
Applicant: 湖南农业大学
Abstract: 一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，是设计两个针对HMGCR基因的CRISPR/Cas9靶标序列，体外合成gRNA单链，经过退火处理获得两个gRNA双链DNA目的插入片段，并分别插入PX459(pSpCas9(BB)‑2A‑Puro)V2.0载体中，获得靶向HMGCR基因两个不同位点的质粒；分别转染该两质粒至PK15细胞中，以嘌呤霉素处理细胞，提取处理后的细胞基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物变性、退火后再利用T7E1进行HMGCR基因敲除鉴定。本方法能用于分析HMGCR基因敲除后的序列和mRNA表达情况，能利用PCR结合T7E1酶处理方法验证有无脱靶现象，从而确定基于靶标序列HMGCR‑gRNA的特异性。本方法不仅可应用于细胞、动物模型中实现HMGCR基因的定点敲除，而且对于实现其它基因的敲除具有参考价值，并具有效果好、简便、经济、时间短等优点。
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公开(公告)号：CN108410907A
公开(公告)日：2018-08-17
申请号：CN201810192797.8
申请日：2018-03-08
Applicant: 湖南农业大学
Abstract: 一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，是设计两个针对HMGCR基因的CRISPR/Cas9靶标序列，体外合成gRNA单链，经过退火处理获得两个gRNA双链DNA目的插入片段，并分别插入PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0载体中，获得靶向HMGCR基因两个不同位点的质粒；分别转染该两质粒至PK15细胞中，以嘌呤霉素处理细胞，提取处理后的细胞基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物变性、退火后再利用T7E1进行HMGCR基因敲除鉴定。本方法能用于分析HMGCR基因敲除后的序列和mRNA表达情况，能利用PCR结合T7E1酶处理方法验证有无脱靶现象，从而确定基于靶标序列HMGCR-gRNA的特异性。本方法不仅可应用于细胞、动物模型中实现HMGCR基因的定点敲除，而且对于实现其它基因的敲除具有参考价值，并具有效果好、简便、经济、时间短等优点。
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