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公开(公告)号：CN116064457A
公开(公告)日：2023-05-05
申请号：CN202211623314.8
申请日：2022-12-16
申请人： 浙江工业大学 , 浙江永太科技股份有限公司 , 浙江永太药业有限公司 , 浙江永太手心医药科技有限公司
摘要： 本发明涉及一种ω‑转氨酶突变体、编码基因，含有编码基因的载体、基因工程菌，以及其在微生物催化制备西他列汀中间体中的应用。所述ω‑转氨酶突变体，由SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第275位、第115位、第97位行单突变或多点联合突变获得。本发明提供了来源于一种曲霉属真菌兰特(Aspergillus lentulus)的转氨酶突变体(生物催化剂)，以西他列汀中间体前体酮(如：1‑哌啶‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)‑1,3‑二丁酮)为底物，同时异丙胺为氨基供体，磷酸吡多醛为辅酶，二甲基亚砜为助溶剂，进行生物催化反应、分离纯化制备高光学纯度的西他列汀中间体，该方法的总收率达到66.7％(包括转化得率及分离纯化收率)，产物e.e.值达到99％(立体选择性高)，具有较好应用前景。
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公开(公告)号：CN111549008B
公开(公告)日：2021-07-23
申请号：CN202010275136.9
申请日：2020-04-09
申请人： 浙江工业大学 , 浙江永太科技股份有限公司 , 浙江永太药业有限公司
摘要： 本发明公开了一种胺转氨酶AcATA突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用，该胺转氨酶AcATA突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第122位进行单突变获得；其中，第122位的甲硫氨酸突变成组氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸。本发明通过分子对接和同源建模等方法获得可能影响其催化活性的位点，并进行了定点突变，最终得到的胺转氨酶AcATA突变体不仅具有较高的酶活，酶活均高于460U/g，均是野生型的4倍以上；而且能够高效催化西他列汀中间体前体酮1‑哌啶‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)‑1,3‑二丁酮合成西他列汀中间体(R)‑3‑氨基‑1‑哌啶‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)‑1‑丁酮，24h转化率高达90％。
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公开(公告)号：CN111411095B
公开(公告)日：2021-07-23
申请号：CN202010277479.9
申请日：2020-04-10
申请人： 浙江工业大学 , 浙江永太科技股份有限公司 , 浙江永太药业有限公司
摘要： 本发明公开了一种新型重组(R)‑ω‑转氨酶及其突变体和应用，该新型重组(R)‑ω‑转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第72位和第248位经单点或二点突变得到。本发明先通过基因重组技术获得高酶活的新型重组(R)‑ω‑转氨酶，再进一步通过定点突变获得新型重组(R)‑ω‑转氨酶突变体，该突变体不仅具有高酶活(1245.2U/g)、高立体选择特性(e.e.值99.9％)，而且能够高效催化前体酮类似物制备西他列汀中间体，转化率最高可达97.4％。
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公开(公告)号：CN111549008A
公开(公告)日：2020-08-18
申请号：CN202010275136.9
申请日：2020-04-09
申请人： 浙江工业大学 , 浙江永太科技股份有限公司 , 浙江永太药业有限公司
摘要： 本发明公开了一种胺转氨酶AcATA突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用，该胺转氨酶AcATA突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第122位进行单突变获得；其中，第122位的甲硫氨酸突变成组氨酸、缬氨酸或苯丙氨酸。本发明通过分子对接和同源建模等方法获得可能影响其催化活性的位点，并进行了定点突变，最终得到的胺转氨酶AcATA突变体不仅具有较高的酶活，酶活均高于460U/g，均是野生型的4倍以上；而且能够高效催化西他列汀中间体前体酮1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-二丁酮合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-哌啶-4-(2,4,5-三氟苯基)-1-丁酮，24h转化率高达90％。
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公开(公告)号：CN111411094A
公开(公告)日：2020-07-14
申请号：CN202010273576.0
申请日：2020-04-09
申请人： 浙江工业大学 , 浙江永太科技股份有限公司 , 浙江永太药业有限公司
摘要： 本发明公开了一种(R)-ω-转氨酶突变体及其应用，该突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第182位的亮氨酸、第79位精氨酸、第51位的谷氨酰胺、第149位的缬氨酸、第235位亮氨酸和第216位甘氨酸，经多点突变得到。本发明通过基因挖掘技术筛选新型的(R)-ω-TA酶，并通过蛋白质工程技术进行分子改造，获得了高酶活、高底物耐受性和高立体选择性的(R)-ω-TA突变体催化剂，该突变体能够生物催化前体酮类似物1-(3-氧吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮合成西他列汀中间体(R)-1-[3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酰基]吡咯-3-酮，且转化率较高，最高可达到95.4％，对于突破西他列汀生物催化制备技术具有里程碑意义。
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公开(公告)号：CN107384887B
公开(公告)日：2020-08-21
申请号：CN201710543569.6
申请日：2017-07-05
申请人： 浙江工业大学 , 浙江永太科技股份有限公司 , 浙江永太药业有限公司
摘要： 本发明公开了一种氨基转移酶、突变体及其制备西他列汀的应用，所述的应用以含有氨基转移酶编码基因的重组大肠杆菌经发酵培养获得的湿菌体作为生物催化剂，以西他列汀前体酮为底物，以二甲基亚砜为助溶剂、以磷酸吡哆醛为辅酶、以异丙胺为辅底物，以pH 8‑9三乙醇胺缓冲液为反应介质构成反应体系，在温度30‑45℃、搅拌速度100‑250r/min的条件下进行生物催化反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得西他列汀；本发明以氨基转移酶及其突变体为生物催化剂，直接以潜手性羰基化合物西他列汀前体酮为底物，同时异丙胺为辅底物，磷酸吡多醛为辅酶，进行生物催化反应、分离纯化制备高光学纯度的西他列汀，该方法的总收率76％，产物e.e.值达到99％。
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公开(公告)号：CN111534494A
公开(公告)日：2020-08-14
申请号：CN202010273326.7
申请日：2020-04-09
申请人： 浙江工业大学 , 浙江永太科技股份有限公司 , 浙江永太药业有限公司
摘要： 本发明公开了一种(R)-ω-转氨酶突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用，该突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第77位的精氨酸、第181位的亮氨酸、第130位的精氨酸、第139位的酪氨酸和第273位苏氨酸经多点突变得到。本发明通过基因挖掘技术筛选新型的(R)-ω-TA重组酶，并通过蛋白质工程技术进行分子改造，获得了高酶活、高底物耐受性和高立体选择性的(R)-ω-TA突变体催化剂，该突变体能够以前体酮类似物1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)-1,3-丁二酮为底物不对称催化合成西他列汀中间体(R)-3-氨基-1-(吡咯烷-1-基)-4-(2,4,5-三氟苯基)丁-1-酮，且转化率较高，最高可达到94.6％。
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公开(公告)号：CN111411095A
公开(公告)日：2020-07-14
申请号：CN202010277479.9
申请日：2020-04-10
申请人： 浙江工业大学 , 浙江永太科技股份有限公司 , 浙江永太药业有限公司
摘要： 本发明公开了一种新型重组(R)-ω-转氨酶及其突变体和应用，该新型重组(R)-ω-转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，突变体由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第72位和第248位经单点或二点突变得到。本发明先通过基因重组技术获得高酶活的新型重组(R)-ω-转氨酶，再进一步通过定点突变获得新型重组(R)-ω-转氨酶突变体，该突变体不仅具有高酶活(1245.2U/g)、高立体选择特性(e.e.值99.9％)，而且能够高效催化前体酮类似物制备西他列汀中间体，转化率最高可达97.4％。
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公开(公告)号：CN112522229B
公开(公告)日：2021-07-27
申请号：CN202011158149.4
申请日：2020-10-26
申请人： 浙江工业大学 , 浙江永太科技股份有限公司 , 浙江永太药业有限公司
摘要： 本发明公开了一种转氨酶突变体及其制备西他列汀中间体的应用，所述突变体是SEQ ID NO：2所示氨基酸序列第74位的酪氨酸取代为脯氨酸、第228位的谷氨酸取代为天冬氨酸、第254位的亮氨酸取代为丙氨酸、第290位的蛋氨酸取代为苏氨酸获得的。本发明以含有转氨酶突变体编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体或纯酶作为生物催化剂，以西他列汀中间体前体酮或潜手性羰基化合物为底物，制备西他列汀中间体或西他列汀酯类中间体；本发明方法的总收率约82％，产物e.e.值达到99％。
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公开(公告)号：CN110540975B
公开(公告)日：2021-04-30
申请号：CN201910800438.0
申请日：2019-08-28
申请人： 浙江工业大学 , 浙江永太科技股份有限公司 , 浙江永太药业有限公司
摘要： 本发明公开了一种ω‑转氨酶突变体及其在制备西他列汀中间体中的应用，该ω‑转氨酶突变体由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第56位或第134位进行单突变获得；第56位的苯丙氨酸替换成缬氨酸、组氨酸或酪氨酸；第134位的苏氨酸替换成甘氨酸。本发明通过分子对接和同源建模等方式获得一些可能影响其催化活性的位点，对其进行了定点突变，最终得到的ω‑转氨酶突变体不仅具有较高的酶活，酶活均高于300U/g，至少是野生型的2.7倍，而且能够高效催化西他列汀中间体前体酮1‑哌啶‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)‑1,3‑二丁酮合成西他列汀中间体(R)‑3‑氨基‑1‑哌啶‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)‑1‑丁酮，转化率高达85％。
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