公开(公告)号：CN113652385B

公开(公告)日：2023-10-03

申请号：CN202110900124.5

申请日：2021-08-06

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  张文立 ,  朱莺莺 ,  李泽宇

IPC: C12N1/21 ,  C12N9/10 ,  C12N9/12 ,  C12N15/61 ,  C12N15/55 ,  C12N15/56 ,  C12N15/70 ,  C12P19/26 ,  C12P19/18 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种高产乳酰‑N‑四糖的微生物的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。本发明以前期构建完成的高效生产前体物质乳酰‑N‑三糖II的菌株为出发菌株，过表达合成乳酰‑N‑四糖的关键基因，使其拥有生产乳酰‑N‑四糖的合成能力。本发明通过筛选高效的β‑1,3‑半乳糖基转移酶基因，并合理设计在载体pCDFDuet‑1上共表达β‑1,3‑半乳糖基转移酶基因和强化UDP‑半乳糖途径关键基因UDP‑葡萄糖4差向异构酶基因(galE)，从而提高乳酰‑N‑四糖的合成，在摇瓶实验中，大肠杆菌生产乳酰‑N‑四糖的能力为3.04g/L，在3L发酵罐中，乳酰‑N‑四糖的产量达到25.49g/L，具备工业应用的前景。

公开(公告)号：CN116355819A

公开(公告)日：2023-06-30

申请号：CN202310187376.7

申请日：2023-03-01

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  朱莺莺 ,  李泽宇 ,  张文立

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/53 ,  C12N15/61 ,  C12N15/56 ,  C12N15/55 ,  C12N15/54 ,  C12P19/26 ,  C12N15/70 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了高效合成乳酰‑N‑四糖的工程大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物代谢工程技术领域。通过CRISPR相关的转座酶系统(CRISPR‑associated transposases,MUCICAT))对大肠杆菌基因组进行多位点的基因编辑，实现大肠杆菌基因组不同拷贝数编码β‑1,3‑乙酰葡萄糖胺转移酶的基因整合，再引入β‑1,3‑半乳糖基转移酶，从而构建了多株生产乳酰‑N‑四糖的工程大肠杆菌，在摇瓶实验过程中，乳酰‑N‑四糖的摇瓶产量可以达到6.07g/L，为进一步工业化生产与合成其他复杂母乳寡糖奠定了基础。

公开(公告)号：CN114990037A

公开(公告)日：2022-09-02

申请号：CN202210573394.4

申请日：2022-05-24

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  张文立 ,  李泽宇 ,  朱莺莺

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/70 ,  C12N15/61 ,  C12N15/56 ,  C12N15/54 ,  C12N15/55 ,  C12N15/53 ,  C12P19/26 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供了一种高产乳酰‑N‑四糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物代谢工程技术领域。本发明以前期研究中获得的高产乳酰‑N‑三糖II的重组大肠杆菌为出发菌株，并在该大肠杆菌基因组上整合有单拷贝的galE，通过质粒组合优化表达lgtA、pF和galE，并通过CRISPR‑Cas9基因编辑系统在大肠杆菌宿主基因组上敲除ugD，以缓解中间产物的代谢分流，同时加强产物合成过程中辅因子的再生与循环，进一步提高乳酰‑N‑四糖的产量，在摇瓶发酵实验过程中，重组大肠杆菌生产乳酰‑N‑四糖的能力为6.16g/L，在5L发酵罐中，乳酰‑N‑四糖的产量达到57.5g/L，为进一步工业化生产乳酰‑N‑四糖奠定了基础。

公开(公告)号：CN116536232A

公开(公告)日：2023-08-04

申请号：CN202310372381.5

申请日：2023-04-10

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  朱莺莺 ,  赵明利 ,  李泽宇 ,  张文立

IPC: C12N1/21 ,  A23L33/125 ,  C12N15/53 ,  C12N15/54 ,  C12N15/56 ,  C12N15/60 ,  C12N15/61 ,  C12N15/70 ,  C12P19/26 ,  A61K35/74 ,  A61K31/702 ,  A61P31/12 ,  A61P37/02 ,  A61P1/00 ,  A61P31/00 ,  A61P43/00 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种高产乳酰‑N‑岩藻糖基五糖Ⅰ的重组大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物代谢工程技术领域。本发明在大肠杆菌基因组上整合尿苷二磷酸半乳糖‑4‑差向异构酶编码基因galE，在基因组IS186多拷贝基因座上插入β‑1,3‑乙酰葡萄糖胺转移酶编码基因lgtA，游离表达β‑1,3‑半乳糖基转移酶编码基因wbgO使底物乳糖转化为乳酰‑N‑四糖。发现鸟苷二磷酸‑岩藻糖的从头合成途径利于乳酰‑N‑岩藻糖基五糖Ⅰ的生产。本发明筛选到既能够提高乳酰‑N‑岩藻糖基五糖Ⅰ的产量，又能避免副产物2′‑岩藻糖基乳糖的生成的α1,2‑岩藻糖基转移酶WbsJ。本发明提供的重组大肠杆菌摇瓶发酵产乳酰‑N‑岩藻糖基五糖Ⅰ达2.53g/L，5L发酵罐产量达30.47g/L，为进一步工业化生产乳酰‑N‑岩藻糖基五糖Ⅰ奠定了基础。

公开(公告)号：CN113652385A

公开(公告)日：2021-11-16

申请号：CN202110900124.5

申请日：2021-08-06

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  张文立 ,  朱莺莺 ,  李泽宇

IPC: C12N1/21 ,  C12N9/10 ,  C12N9/12 ,  C12N15/61 ,  C12N15/55 ,  C12N15/56 ,  C12N15/70 ,  C12P19/00 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明公开了一种高产乳酰‑N‑四糖的微生物的构建方法及应用，属于微生物基因工程领域。本发明以前期构建完成的高效生产前体物质乳酰‑N‑三糖II的菌株为出发菌株，过表达合成乳酰‑N‑四糖的关键基因，使其拥有生产乳酰‑N‑四糖的合成能力。本发明通过筛选高效的β‑1,3‑半乳糖基转移酶基因，并合理设计在载体pCDFDuet‑1上共表达β‑1,3‑半乳糖基转移酶基因和强化UDP‑半乳糖途径关键基因UDP‑葡萄糖4差向异构酶基因(galE)，从而提高乳酰‑N‑四糖的合成，在摇瓶实验中，大肠杆菌生产乳酰‑N‑四糖的能力为3.04g/L，在3L发酵罐中，乳酰‑N‑四糖的产量达到25.49g/L，具备工业应用的前景。

公开(公告)号：CN114990037B

公开(公告)日：2024-03-26

申请号：CN202210573394.4

申请日：2022-05-24

Applicant: 江南大学

Inventor： 沐万孟 ,  张文立 ,  李泽宇 ,  朱莺莺

IPC: C12N1/21 ,  C12N15/70 ,  C12N15/61 ,  C12N15/56 ,  C12N15/54 ,  C12N15/55 ,  C12N15/53 ,  C12P19/26 ,  C12R1/19

Abstract: 本发明提供了一种高产乳酰‑N‑四糖的重组大肠杆菌的构建方法及应用，属于微生物代谢工程技术领域。本发明以前期研究中获得的高产乳酰‑N‑三糖II的重组大肠杆菌为出发菌株，并在该大肠杆菌基因组上整合有单拷贝的galE，通过质粒组合优化表达lgtA、pF和galE，并通过CRISPR‑Cas9基因编辑系统在大肠杆菌宿主基因组上敲除ugD，以缓解中间产物的代谢分流，同时加强产物合成过程中辅因子的再生与循环，进一步提高乳酰‑N‑四糖的产量，在摇瓶发酵实验过程中，重组大肠杆菌生产乳酰‑N‑四糖的能力为6.16g/L，在5L发酵罐中，乳酰‑N‑四糖的产量达到57.5g/L，为进一步工业化生产乳酰‑N‑四糖奠定了基础。