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公开(公告)号：CN106636197B
公开(公告)日：2019-09-03
申请号：CN201610843834.8
申请日：2016-09-22
Applicant: 南京市妇幼保健院 , 南京大学 , 南京尧顺禹生物科技有限公司
Abstract: 本发明公开了一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，包括以下步骤：步骤一：斑马鱼胚胎的制备；步骤二：dCas9‑Eve融合蛋白的表达载体构建；步骤三：进行sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9和基因的体外转录，再将体外转录合成的sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9mRNA和基因mRNA用RNeasy Mini Kit进行纯化；步骤四：sgRNA的活性鉴定；步骤五：dCas9‑Eve法敲降多拷贝基因znfl1s的表达，用胚胎整体原位杂交法通过检测基因的表达，判定基因表达被敲降的情况。本发明利用dCas9‑Eve的方法，在有效靶向识别基因启动子的sgRNA存在的情况下，可特异敲降基因的转录，避免了在研究基因在胚胎早期发育中受MO毒性或者脱靶导致的非特异性表型的影响，而且Eve抑制转录结构域是斑马鱼来源的，因此dCas9‑Eve可以适用于对任何斑马鱼基因在转录水平的敲降。
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公开(公告)号：CN102653756A
公开(公告)日：2012-09-05
申请号：CN201110052372.5
申请日：2011-03-04
Applicant: 南京大学
Abstract: 本发明涉及利用一种定向诱变动物基因组的方法。具体来说，本发明提供一种新的利用锌指核酸酶定向改造动物基因组的特定基因的方法，包括：根据目标动物靶基因区的序列设计特异识别并切割靶基因的锌指核酸酶，使用独立的表达系统验证所述锌指核酸酶对靶基因的定向切割能力和效率，利用选定的锌指核酸酶对目标动物的胚胎的靶基因进行定向遗传改造并获得稳定的遗传性状。进一步，本发明还涉及使用所述的独立表达系统，筛选利用所设计的锌指核酸酶所获得的主要的基因突变模式，并利用选定的突变模式高效筛选定向遗传改造所获得的子代。另一方面，本发明还涉及利用所述方法，获得能特异识别黄颡鱼肌肉生长抑制素基因的锌指核酸酶，并定向地敲除了黄颡鱼的肌肉生长抑制素基因。
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公开(公告)号：CN1876809A
公开(公告)日：2006-12-13
申请号：CN200610038917.6
申请日：2006-03-17
Applicant: 南京大学
Abstract: 本发明公开了一种转聚磷激酶基因的大肠杆菌的构建方法，该方法包括基因的克隆和载体的构建；克隆包括：提取大肠杆菌的总DNA；设计引物，扩增ppk基因；扩增出的目的基因重组到克隆载体pMD18－T中；转化大肠杆菌DH5α；构建包括：采用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切带有ppk目的基因的pMD18－T质粒和空表达载体pET－28a(+)；将目的基因通过T4连接酶定向连接到表达载体pET－28a(+)中，然后转化DH5α；利用PCR和双酶切的方法筛选鉴定出阳性重组子；提取出重组质粒pET28a－PPK，转化受体菌株BL21(DE3)中。本发明工艺简单，所得基因菌具有高效的去除磷的能力。
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公开(公告)号：CN107686842A
公开(公告)日：2018-02-13
申请号：CN201610627960.X
申请日：2016-08-03
Applicant: 南京大学
IPC: C12N15/63 , C12N15/113
CPC classification number: C12N15/113 , C12N15/63 , C12N2310/10 , C12N2800/80
Abstract: 本发明涉及一种靶多核苷酸编辑方法，具体步骤包括针对目标靶基因，设计一对DNA寡核苷酸单链，使其与靶基因的正义和反义链分别互补，分别产生能够被一类识别靶序列结构并具有切割活性的核酸酶识别的结构，通过所述的核酸酶切割靶基因组DNA，实现对基因组的编辑。其中，所述被一类识别靶序列结构并具有切割活性的核酸酶识别的结构为3'-Flap结构，DNA寡核苷酸单链的3'末端不与靶基因互补；重组的结构识别核酸内切酶，包含结构识别功能域、DNA切割功能域、连接二者的肽段和核定位信号。
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公开(公告)号：CN106636197A
公开(公告)日：2017-05-10
申请号：CN201610843834.8
申请日：2016-09-22
Applicant: 南京市妇幼保健院 , 南京大学 , 南京尧顺禹生物科技有限公司
Abstract: 本发明公开了一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，包括以下步骤：步骤一：斑马鱼胚胎的制备；步骤二：dCas9‑Eve融合蛋白的表达载体构建；步骤三：进行sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9和基因的体外转录，再将体外转录合成的sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9mRNA和基因mRNA用RNeasy Mini Kit进行纯化；步骤四：sgRNA的活性鉴定；步骤五：dCas9‑Eve法敲降多拷贝基因znfl1s的表达，用胚胎整体原位杂交法通过检测基因的表达，判定基因表达被敲降的情况。本发明利用dCas9‑Eve的方法，在有效靶向识别基因启动子的sgRNA存在的情况下，可特异敲降基因的转录，避免了在研究基因在胚胎早期发育中受MO毒性或者脱靶导致的非特异性表型的影响，而且Eve抑制转录结构域是斑马鱼来源的，因此dCas9‑Eve可以适用于对任何斑马鱼基因在转录水平的敲降。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN104195177A
公开(公告)日：2014-12-10
申请号：CN201410382563.1
申请日：2014-08-05
Applicant: 南京大学
IPC: C12N15/89
Abstract: 一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法，包括：设计特异性识别和切割鱼类基因组指定位点序列的基因组编辑工具、以及与所述指定位点序列相对应、包含敲入外源基因片段的同源供体，使用共显微注射的方法将所述基因组编辑工具、所述同源供体以及在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的mRNA导入到鱼类动物胚胎，利用检测所述荧光蛋白mRNA所表达的荧光蛋白进行胚胎挑选并获得稳定的遗传性状。该方法可以在鱼类基因组的指定位点敲入外源基因片段，获得带有敲入的外源基因片段的子一代鱼类的效率显著高于已有的方法。
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公开(公告)号：CN102653756B
公开(公告)日：2014-10-08
申请号：CN201110052372.5
申请日：2011-03-04
Applicant: 南京大学
Abstract: 本发明涉及利用一种定向诱变动物基因组的方法。具体来说，本发明提供一种新的利用锌指核酸酶定向改造动物基因组的特定基因的方法，包括：根据目标动物靶基因区的序列设计特异识别并切割靶基因的锌指核酸酶，使用独立的表达系统验证所述锌指核酸酶对靶基因的定向切割能力和效率，利用选定的锌指核酸酶对目标动物的胚胎的靶基因进行定向遗传改造并获得稳定的遗传性状。进一步，本发明还涉及使用所述的独立表达系统，筛选利用所设计的锌指核酸酶所获得的主要的基因突变模式，并利用选定的突变模式高效筛选定向遗传改造所获得的子代。另一方面，本发明还涉及利用所述方法，获得能特异识别黄颡鱼肌肉生长抑制素基因的锌指核酸酶，并定向地敲除了黄颡鱼的肌肉生长抑制素基因。
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公开(公告)号：CN102191270B
公开(公告)日：2014-04-16
申请号：CN201010116126.7
申请日：2010-03-03
Applicant: 南京大学
IPC: C12N15/85
Abstract: 本发明公开了一种黄颡鱼的β-肌动蛋白启动子、生长激素基因及其3’-非翻译区序列以及以此为元件构建的黄颡鱼本源转基因载体。本发明获得了黄颡鱼的β-肌动蛋白启动子序列以及外显子1和部分外显子2的序列，还获得了黄颡鱼生长激素基因的氨基酸编码序列和3’-非翻译区序列，并以获得的黄颡鱼β-肌动蛋白的启动子、生长激素编码基因以及3’-非翻译区为元件构建黄颡鱼本源生长激素转基因载体。本发明用黄颡鱼自身的β-肌动蛋白的启动子驱动其自身的生长激素基因表达的方法来构建转基因载体，能有效地避免转基因鱼所面临的生物安全性问题，对黄颡鱼基因育种与人工繁殖有重大的实际意义和应用前景。
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公开(公告)号：CN100513555C
公开(公告)日：2009-07-15
申请号：CN200610038917.6
申请日：2006-03-17
Applicant: 南京大学
Abstract: 本发明公开了一种转聚磷激酶基因的大肠杆菌的构建方法，该方法包括基因的克隆和载体的构建；克隆包括：提取大肠杆菌的总DNA；设计引物，扩增ppk基因；扩增出的目的基因重组到克隆载体pMD18-T中；转化大肠杆菌DH5α；构建包括：采用限制性内切酶BamH I和HindIII双酶切带有ppk目的基因的pMD18-T质粒和空表达载体pET-28a(+)；将目的基因通过T4连接酶定向连接到表达载体pET-28a(+)中，然后转化DH5α；利用PCR和双酶切的方法筛选鉴定出阳性重组子；提取出重组质粒pET28a-PPK，转化受体菌株BL21(DE3)中。本发明工艺简单，所得基因菌具有高效的去除磷的能力。
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公开(公告)号：CN104195177B
公开(公告)日：2017-06-09
申请号：CN201410382563.1
申请日：2014-08-05
Applicant: 南京大学
IPC: C12N15/89
Abstract: 一种显著提高鱼类基因组编辑效率的方法，包括：设计特异性识别和切割鱼类基因组指定位点序列的基因组编辑工具、以及与所述指定位点序列相对应、包含敲入外源基因片段的同源供体，使用共显微注射的方法将所述基因组编辑工具、所述同源供体以及在原生殖细胞特异稳定表达荧光蛋白的mRNA导入到鱼类动物胚胎，利用检测所述荧光蛋白mRNA所表达的荧光蛋白进行胚胎挑选并获得稳定的遗传性状。该方法可以在鱼类基因组的指定位点敲入外源基因片段，获得带有敲入的外源基因片段的子一代鱼类的效率显著高于已有的方法。
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