公开(公告)号：CN106636197A

公开(公告)日：2017-05-10

申请号：CN201610843834.8

申请日：2016-09-22

Applicant: 南京市妇幼保健院 ,  南京大学 ,  南京尧顺禹生物科技有限公司

Inventor： 李俊 ,  赵庆顺 ,  李景云 ,  顾淳 ,  董晓华

IPC: C12N15/85 ,  C12N5/10

Abstract: 本发明公开了一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，包括以下步骤：步骤一：斑马鱼胚胎的制备；步骤二：dCas9‑Eve融合蛋白的表达载体构建；步骤三：进行sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9和基因的体外转录，再将体外转录合成的sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9mRNA和基因mRNA用RNeasy Mini Kit进行纯化；步骤四：sgRNA的活性鉴定；步骤五：dCas9‑Eve法敲降多拷贝基因znfl1s的表达，用胚胎整体原位杂交法通过检测基因的表达，判定基因表达被敲降的情况。本发明利用dCas9‑Eve的方法，在有效靶向识别基因启动子的sgRNA存在的情况下，可特异敲降基因的转录，避免了在研究基因在胚胎早期发育中受MO毒性或者脱靶导致的非特异性表型的影响，而且Eve抑制转录结构域是斑马鱼来源的，因此dCas9‑Eve可以适用于对任何斑马鱼基因在转录水平的敲降。

公开(公告)号：CN106636197B

公开(公告)日：2019-09-03

申请号：CN201610843834.8

申请日：2016-09-22

Applicant: 南京市妇幼保健院 ,  南京大学 ,  南京尧顺禹生物科技有限公司

Inventor： 李俊 ,  赵庆顺 ,  李景云 ,  顾淳 ,  董晓华

IPC: C12N15/85 ,  C12N5/10

Abstract: 本发明公开了一种定向敲降斑马鱼基因组中多拷贝基因的方法，包括以下步骤：步骤一：斑马鱼胚胎的制备；步骤二：dCas9‑Eve融合蛋白的表达载体构建；步骤三：进行sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9和基因的体外转录，再将体外转录合成的sgRNA、dCas9‑Eve、Cas9mRNA和基因mRNA用RNeasy Mini Kit进行纯化；步骤四：sgRNA的活性鉴定；步骤五：dCas9‑Eve法敲降多拷贝基因znfl1s的表达，用胚胎整体原位杂交法通过检测基因的表达，判定基因表达被敲降的情况。本发明利用dCas9‑Eve的方法，在有效靶向识别基因启动子的sgRNA存在的情况下，可特异敲降基因的转录，避免了在研究基因在胚胎早期发育中受MO毒性或者脱靶导致的非特异性表型的影响，而且Eve抑制转录结构域是斑马鱼来源的，因此dCas9‑Eve可以适用于对任何斑马鱼基因在转录水平的敲降。

公开(公告)号：CN109207524A

公开(公告)日：2019-01-15

申请号：CN201710545564.7

申请日：2017-06-29

Applicant: 南京尧顺禹生物科技有限公司

Inventor： 赵庆顺 ,  董晓华 ,  储乐乐 ,  池军

IPC: C12N15/90 ,  C12N9/22 ,  C12N15/113 ,  A01K67/027 ,  A61K49/00

CPC classification number: C12N15/902 ,  A01K67/0276 ,  A01K2207/15 ,  A01K2217/075 ,  A01K2227/40 ,  A01K2267/0362 ,  A61K49/0008 ,  C12N9/22 ,  C12N15/113

Abstract: 本发明涉及基于FTO基因的人类肥胖症斑马鱼模型的建立与应用，具体步骤包括针对斑马鱼fto基因编码关键功能结构域的外显子设计CRISPR序列，筛选确认可有效引导Cas9切割目标基因的活性sgRNA，然后运用有活性的sgRNA，制备fto基因敲除的初建者，待初建者生长至性成熟，令其自由交配，产生F1代；通过对F1个体的基因型鉴定，筛选fto基因敲除的斑马鱼突变体；通过对fto基因纯合突变的分析，确立fto的功能缺失有益于斑马鱼仔鱼的脂肪累积的减少，建立基于fto基因的人类肥胖症的斑马鱼模型，进而可将fto作为标识基因应用于筛选与建立治疗人类肥胖症的新药物与新方法。

公开(公告)号：CN109207523A

公开(公告)日：2019-01-15

申请号：CN201710545563.2

申请日：2017-06-29

Applicant: 南京尧顺禹生物科技有限公司

Inventor： 赵庆顺 ,  董晓华 ,  储乐乐 ,  池军

IPC: C12N15/90 ,  C12N15/113 ,  A01K67/027 ,  A61K49/00

CPC classification number: C12N15/902 ,  A01K67/0276 ,  A01K2207/15 ,  A01K2217/075 ,  A01K2227/40 ,  A01K2267/0362 ,  A61K49/0008 ,  C12N15/113

Abstract: 本发明涉及基于UCP1基因的人类肥胖症斑马鱼模型的建立与应用，具体步骤包括针对斑马鱼ucp1基因编码关键功能结构域的外显子设计CRISPR序列，筛选确认可有效引导Cas9切割目标基因的活性sgRNA，然后运用有活性的sgRNA，制备ucp1基因敲除的初建者，待初建者生长至性成熟，令其自由交配，产生F1代；通过对F1个体的基因型鉴定，筛选fto基因敲除的斑马鱼突变体；通过对ucp1基因纯合突变的分析，确立ucp1的功能缺失有益于斑马鱼仔鱼的脂肪累积的减少，建立基于ucp1基因的人类肥胖症的斑马鱼模型，进而将ucp1作为标识基因应用于筛选与建立治疗人类肥胖症的新药物与新方法。