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公开(公告)号：CN114958900A
公开(公告)日：2022-08-30
申请号：CN202210528110.X
申请日：2022-05-16
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了一种解脂耶氏酵母无标记整合载体及其应用用，属于微生物基因工程领域。该整合载体包括重组反应区，重组反应区包括从5’至3’顺序的左臂突变型lox序列、待剔除DNA片段和右臂突变型lox序列；左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列方向相同；待剔除DNA片段包括解脂耶氏酵母筛选标记、Cre基因诱导表达盒、大肠杆菌筛选标记和复制起点；所述左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列能在所述载体整合至解脂耶氏酵母基因组后，在Cre重组酶作用下切除左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列之间的序列，并在基因组上生成双臂突变型lox序列。本发明仅需单个载体即可高效便捷地实现基因的无标记整合，为在解脂耶氏酵母体内整合多个基因提供了极大的便利。
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公开(公告)号：CN115418371B
公开(公告)日：2024-07-02
申请号：CN202210974824.3
申请日：2022-08-15
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了一种解脂耶氏酵母中基因连续无标记整合系统及应用，属于微生物基因工程领域。本发明整合系统基于Cre/loxP位点特异性重组，首先通过第一型载体转化宿主完成第一轮基因无标记整合并引入左臂或右臂突变型lox序列，随后通过交替使用携带有两种特定组合的左臂、右臂突变型lox序列的第二型载体和第三型载体，最终能够高效地在解脂耶氏酵母基因组单个位点处实现目的基因的连续无标记整合。本发明仅需使用单个酵母筛选标记，且能高效地实现大肠杆菌复制起点与筛选标记、Cre基因表达盒、酵母筛选标记及冗余的同源片段等几乎所有非必须DNA片段的剔除，使得多个目的基因表达盒能以特定方式在单个基因位点处实现连续无标记整合。
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公开(公告)号：CN118374535A
公开(公告)日：2024-07-23
申请号：CN202410528445.0
申请日：2024-04-29
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了一种毕赤酵母高效无痕基因敲除载体及其应用，属于微生物基因工程领域。本发明毕赤酵母高效无痕基因敲除载体包括两个不同条件诱导的压力基因表达盒、筛选基因表达盒、待敲除片段的上、下游同源序列及该片段内部同源序列；本发明中敲除载体单交换整合入目的位点后，通过引导两轮分子内重组后即可高效地实现基因无痕敲除。本发明不需抑制NEHJ途径，仅需单个载体即可非常高效地实现毕赤酵母中基因的无痕敲除。
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公开(公告)号：CN115418371A
公开(公告)日：2022-12-02
申请号：CN202210974824.3
申请日：2022-08-15
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了一种解脂耶氏酵母中基因连续无标记整合系统及应用，属于微生物基因工程领域。本发明整合系统基于Cre/loxP位点特异性重组，首先通过第一型载体转化宿主完成第一轮基因无标记整合并引入左臂或右臂突变型lox序列，随后通过交替使用携带有两种特定组合的左臂、右臂突变型lox序列的第二型载体和第三型载体，最终能够高效地在解脂耶氏酵母基因组单个位点处实现目的基因的连续无标记整合。本发明仅需使用单个酵母筛选标记，且能高效地实现大肠杆菌复制起点与筛选标记、Cre基因表达盒、酵母筛选标记及冗余的同源片段等几乎所有非必须DNA片段的剔除，使得多个目的基因表达盒能以特定方式在单个基因位点处实现连续无标记整合。
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公开(公告)号：CN114958900B
公开(公告)日：2024-04-19
申请号：CN202210528110.X
申请日：2022-05-16
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了一种解脂耶氏酵母无标记整合载体及其应用用，属于微生物基因工程领域。该整合载体包括重组反应区，重组反应区包括从5’至3’顺序的左臂突变型lox序列、待剔除DNA片段和右臂突变型lox序列；左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列方向相同；待剔除DNA片段包括解脂耶氏酵母筛选标记、Cre基因诱导表达盒、大肠杆菌筛选标记和复制起点；所述左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列能在所述载体整合至解脂耶氏酵母基因组后，在Cre重组酶作用下切除左臂突变型lox序列和右臂突变型lox序列之间的序列，并在基因组上生成双臂突变型lox序列。本发明仅需单个载体即可高效便捷地实现基因的无标记整合，为在解脂耶氏酵母体内整合多个基因提供了极大的便利。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN112391402B
公开(公告)日：2023-03-28
申请号：CN202011283106.9
申请日：2020-11-17
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明属于基因工程技术领域，公开了一种提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平的方法，该方法是通过共同过表达蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白以提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平。共同过表达优选包括以下任意一种情形：(i)目的蛋白基因与一种辅助蛋白的单拷贝基因的共同过表达；(ii)目的蛋白基因与一种辅助蛋白的多拷贝基因的共同过表达；(iii)目的蛋白基因与多种辅助蛋白的不同拷贝数基因的共同过表达。本发明通过对提升方法的整体作用机制进行改进，通过共同过表达蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白以提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平，可显著提高解脂耶氏酵母中目的蛋白的产量。
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公开(公告)号：CN115449524A
公开(公告)日：2022-12-09
申请号：CN202211122390.0
申请日：2022-09-15
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了一种酵母中重复序列介导的基因无抗性整合系统及应用，属于基因工程领域。本发明首先选择或构建某参与细胞重要生理功能基因其表达盒一端存在突变或缺失而导致功能不足的缺陷型菌株，随后在特定位点整合携带该基因表达盒另一端中部分序列突变或缺失的截短型表达盒的表达载体，在菌株需要该基因功能才能正常生长或代谢的培养条件下，载体引入的截短型表达盒和缺陷型菌株中缺陷基因片段所含重复序列之间将通过分子内同源重组生成完整基因表达盒并剔除表达载体引入的抗生素基因，最终实现无抗性整合。本发明不需借助CRISPR‑Cas和位点特异性重组系统等基因编辑工具，可高效地实现外源基因在酵母中的无抗性整合，且操作简单。
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公开(公告)号：CN112391402A
公开(公告)日：2021-02-23
申请号：CN202011283106.9
申请日：2020-11-17
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明属于基因工程技术领域，公开了一种提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平的方法，该方法是通过共同过表达蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白以提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平。共同过表达优选包括以下任意一种情形：(i)目的蛋白基因与一种辅助蛋白的单拷贝基因的共同过表达；(ii)目的蛋白基因与一种辅助蛋白的多拷贝基因的共同过表达；(iii)目的蛋白基因与多种辅助蛋白的不同拷贝数基因的共同过表达。本发明通过对提升方法的整体作用机制进行改进，通过共同过表达蛋白合成与分泌途径相关的辅助蛋白以提高解脂耶氏酵母中目的蛋白表达水平，可显著提高解脂耶氏酵母中目的蛋白的产量。
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公开(公告)号：CN119685371A
公开(公告)日：2025-03-25
申请号：CN202411908792.2
申请日：2024-12-24
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了一种提高解脂耶氏酵母精准无痕基因编辑效率的方法，属于微生物基因工程领域。本发明提高解脂耶氏酵母精准无痕基因编辑效率的方法包括构建游离型的含有重组酶和待编辑序列上下游同源序列的基因编辑质粒，以及质粒转化后的培养方法。本发明无需抑制NHEJ途径，最终得到的工程菌不会留下冗余序列或者质粒，仅需单个载体即可明显提高解脂耶氏酵母精准基因编辑的效率。
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公开(公告)号：CN115449524B
公开(公告)日：2024-08-27
申请号：CN202211122390.0
申请日：2022-09-15
Applicant: 华中科技大学
Abstract: 本发明公开了一种酵母中重复序列介导的基因无抗性整合系统及应用，属于基因工程领域。本发明首先选择或构建某参与细胞重要生理功能基因其表达盒一端存在突变或缺失而导致功能不足的缺陷型菌株，随后在特定位点整合携带该基因表达盒另一端中部分序列突变或缺失的截短型表达盒的表达载体，在菌株需要该基因功能才能正常生长或代谢的培养条件下，载体引入的截短型表达盒和缺陷型菌株中缺陷基因片段所含重复序列之间将通过分子内同源重组生成完整基因表达盒并剔除表达载体引入的抗生素基因，最终实现无抗性整合。本发明不需借助CRISPR‑Cas和位点特异性重组系统等基因编辑工具，可高效地实现外源基因在酵母中的无抗性整合，且操作简单。
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