公开(公告)号：CN110684855B

公开(公告)日：2021-08-03

申请号：CN201911000642.0

申请日：2019-10-21

Applicant: 华中农业大学

Inventor： 顾泽茂 ,  张琦 ,  胡瑞雪

IPC: C12Q1/689 ,  C12Q1/6851 ,  C12Q1/06 ,  C12N15/11 ,  C12R1/01

Abstract: 本发明公开了一种检测米尔伊丽莎白菌的实时荧光定量PCR检测方法，步骤是：A、引物设计：上游引物：5'ACCTTAAAAGACAAGAAGCTG 3'；下游引物：5'AGTTGTCTTCACCGTATGCC 3'；B、反应体系的优化：得到反应体系为：SYBR Premix Ex Taq 2×SYBR Green Mix 10μL，10pmol/μL上下游引物各1μL，RNase Free ddH2O 7μL；C、阳性标准品的制备：提取米尔伊丽莎白菌样品DNA，为模板，上游引物和下游引物扩增片段长度，对目的片段使用胶回收试剂盒切胶回收后克隆到pMD‑19T载体上，转化导入DH5α，扩大培养后提取重组质粒，测定核酸浓度，转化为拷贝数，为阳性标准品；D、标准曲线的建立：将质粒稀释，以稀释液为模板，按照反应体系进行PCR扩增，建立标准曲线；E、待测样品的检测。解决了其中存在的费时费力、容易污染及检测结果波动性的问题。

公开(公告)号：CN110684855A

公开(公告)日：2020-01-14

申请号：CN201911000642.0

申请日：2019-10-21

Applicant: 华中农业大学

Inventor： 顾泽茂 ,  张琦 ,  胡瑞雪

IPC: C12Q1/689 ,  C12Q1/6851 ,  C12Q1/06 ,  C12N15/11 ,  C12R1/01

Abstract: 本发明公开了一种检测米尔伊丽莎白菌的实时荧光定量PCR检测方法，步骤是：A、引物设计：上游引物：5'ACCTTAAAAGACAAGAAGCTG 3'；下游引物：5'AGTTGTCTTCACCGTATGCC 3'；B、反应体系的优化：得到反应体系为：SYBR Premix Ex Taq 2×SYBR Green Mix 10μL，10pmol/μL上下游引物各1μL，RNase Free ddH2O 7μL；C、阳性标准品的制备：提取米尔伊丽莎白菌样品DNA，为模板，上游引物和下游引物扩增片段长度，对目的片段使用胶回收试剂盒切胶回收后克隆到pMD-19T载体上，转化导入DH5α，扩大培养后提取重组质粒，测定核酸浓度，转化为拷贝数，为阳性标准品；D、标准曲线的建立： 将质粒稀释，以稀释液为模板，按照反应体系进行PCR扩增，建立标准曲线；E、待测样品的检测。解决了其中存在的费时费力、容易污染及检测结果波动性的问题。