公开(公告)号：CN110317777A

公开(公告)日：2019-10-11

申请号：CN201910735940.8

申请日：2019-08-09

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 秦晓东 ,  何祥一 ,  曾飒 ,  张志东

IPC: C12N5/071

Abstract: 本发明公开了一种口腔黏膜上皮细胞的分离和培养方法，具体涉及细胞培养技术领域，具体分离和培养步骤如下：无菌条件下取唇裂整复术中切除的多余口腔黏膜组织，用PBS反复冲洗，用眼科剪除去黏膜下组织，剪成小块，置于DispaseⅡ酶中，4℃过夜消化18h，用眼科镊分离上皮层，PBS液冲洗上皮层，将上皮剪切成小片加入混合消化液中，37℃消化7分钟，加胎牛血清终止消化，用吸管反复吹打至单细胞悬液，离心弃上清，加入无血清培养基，接种于培养瓶中倒置培养，当原代培养的细胞汇合率达70％-80％时，用0.25％胰蛋白酶/0.02％EDTA消化并以1:2传代。本发明整个培养过程简单，得到的原代培养细胞成活率高，并且不易出现双核、多核、畸形核细胞。

公开(公告)号：CN110241075A

公开(公告)日：2019-09-17

申请号：CN201910534620.6

申请日：2019-06-20

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 秦晓东 ,  何祥一 ,  曾飒 ,  张志东

IPC: C12N5/077

Abstract: 本发明公开了一种人正常PDLCs的分离和培养的方法，具体涉及细胞培养技术领域，包括以下步骤：步骤一，取第一前磨牙放置于烧杯容器内，向烧杯容器内倒入pH值在7.2-7.4的PBS缓冲液对第一前磨牙进行冲洗，然后重复冲洗五次，去除第一前磨牙表面的污垢和杂质；步骤二，将冲洗后的第一前磨牙放在无菌环境下进行晾干后，刮取第一前磨牙根部外壁上的1/3牙周膜，添加至容器内。本发明通过对人体牙周膜细胞进行提取，并对提取后的细胞进行多次PBS冲洗，细胞经过PBS清洗会去除细胞中的杂质，能够保持细胞能在适合的PH值范围之内，并对牙周膜细胞进行消化离心，使得分离后的牙周膜细胞便于进行培养，提高了牙周膜细胞在培养过程中的成活率。

公开(公告)号：CN110229809A

公开(公告)日：2019-09-13

申请号：CN201910534645.6

申请日：2019-06-20

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 张志东 ,  秦晓东 ,  何祥一 ,  曾飒

IPC: C12N15/10

Abstract: 本发明公开了一种Rochel反转录试剂及其制备方法，具体涉及细胞生物科技领域，包括去离子水、EASY Dilution for Real Time PCR、gDNA Eraser、5x gDNA Eraser Buffer、RNase抑制剂和基因引物，所述基因引物包括端粒酶反转录酶、酸甘油醛脱氢酶、碱性磷酸酶、核心结合因子、骨涎蛋白、骨钙素、骨桥素和Ⅰ型胶原蛋白。本发明通过设有多种组合基因引物，便于骨质细胞繁殖，应用过程中反转录速度快，且成活率高，生长率好，有利于牙周膜再生治疗研究，生产过程中无菌处理，并采用低温储存，反转录试剂质量好，储备时间长，能够满足DNA生物合成需要。

公开(公告)号：CN110229793A

公开(公告)日：2019-09-13

申请号：CN201910534638.6

申请日：2019-06-20

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 秦晓东 ,  何祥一 ,  曾飒 ,  张志东

IPC: C12N7/01 ,  C12N15/63

Abstract: 本发明公开了一种腺病毒颗粒获得方法，具体涉及腺病毒获取领域，具体操作步骤如下：S1、pshuttle-cmv-hTERT穿梭质粒的构建；S2、BJ5183/p超级感受态的制备；S3、同源重组腺病毒质粒构建；S4、腺病毒颗粒收集。本发明通过pshuttle-cmv-hTERT穿梭质粒的构建、BJ5183/p超级感受态的制备、同源重组腺病毒质粒构建以及腺病毒颗粒收集共四个步骤，能够稳定的获取腺病毒，且每次获取的腺病毒颗粒数都能够保持稳定，相比于现有技术中腺病毒的获取，获取效率以及稳定性都得到了很大的提高。

公开(公告)号：CN110499331A

公开(公告)日：2019-11-26

申请号：CN201910735113.9

申请日：2019-08-09

Applicant: 中国农业科学院兰州兽医研究所

Inventor： 秦晓东 ,  何祥一 ,  曾飒 ,  张志东

IPC: C12N15/867 ,  C12N15/66 ,  C12N15/54

Abstract: 本发明公开了外源性人端粒酶反转录酶基因重组慢病毒颗粒的获得方法，具体涉及生物技术领域，包括以下步骤：S1、准备材料和试剂；S2、构建pLVX-puro-hTERT重组慢病毒载体；S3、表达hTERT基因重组慢病毒颗粒的获得。本发明通过携带有外源基因的慢病毒载体在慢病毒包装质粒、细胞系的辅助下，经过病毒包装成为有感染力的病毒颗粒，慢病毒载体能够将目的基因高效整合于宿主基因组，从而实现外源基因长期、稳定的表达，整个慢病毒颗粒获取操作方便，获取的慢病毒颗粒对于后期的感染细胞，使正常体细胞永生化得到保证，可获得稳定增殖的永生化细胞系，并且侵染效率高，稳定性较好。