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公开(公告)号：CN108410907A
公开(公告)日：2018-08-17
申请号：CN201810192797.8
申请日：2018-03-08
Applicant: 湖南农业大学
Abstract: 一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，是设计两个针对HMGCR基因的CRISPR/Cas9靶标序列，体外合成gRNA单链，经过退火处理获得两个gRNA双链DNA目的插入片段，并分别插入PX459(pSpCas9(BB)-2A-Puro)V2.0载体中，获得靶向HMGCR基因两个不同位点的质粒；分别转染该两质粒至PK15细胞中，以嘌呤霉素处理细胞，提取处理后的细胞基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物变性、退火后再利用T7E1进行HMGCR基因敲除鉴定。本方法能用于分析HMGCR基因敲除后的序列和mRNA表达情况，能利用PCR结合T7E1酶处理方法验证有无脱靶现象，从而确定基于靶标序列HMGCR-gRNA的特异性。本方法不仅可应用于细胞、动物模型中实现HMGCR基因的定点敲除，而且对于实现其它基因的敲除具有参考价值，并具有效果好、简便、经济、时间短等优点。
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公开(公告)号：CN104073473B
公开(公告)日：2016-03-23
申请号：CN201410145870.8
申请日：2014-04-11
Applicant: 美国普赛生物高科技有限责任公司 , 湖南农业大学
Abstract: 本发明公开了一种PCV2病毒样颗粒及其制备方法和裂解及VLP组装缓冲液。基于自主优化设计，并人工合成适合在原核表达系统中高效表达的PCV2核衣壳蛋白基因，通过大肠杆菌原核表达系统表达PCV2核衣壳蛋白的全长基因序列，并利用其可溶性核衣壳蛋白在特定条件下高效自体组装成了病毒样颗粒。本发明创新点主要在于采用不同于常规的真核表达系统获取VLPs方法，而是利用原核表达系统获取PCV2VLPs，本方法成本低廉、简单高效，适合大规模产业化应用；其中还应用到独创的既可以促进菌体裂解又能适合VLPs自体组装的双功能于一体的缓冲液配方；另外发明所获得的PCV2病毒样颗粒与野生型病毒外形相似度高，并且免疫原性好，可以用于研发具有应用潜力的猪圆环病毒的亚单位疫苗及药物传递载体。
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公开(公告)号：CN104498439A
公开(公告)日：2015-04-08
申请号：CN201410712094.5
申请日：2014-11-28
Applicant: 湖南农业大学
IPC: C12N5/20 , C07K16/08 , G01N33/577 , G01N33/569 , A61K39/42 , A61P31/20 , B01D15/38 , C12M1/00
Abstract: 本发明提供了一种杂交瘤细胞、PCV2单克隆抗体及其应用。本发明通过创造性地采用PCV2病毒样颗粒作为免疫原，由于PCV2病毒样颗粒是更接近于正常PCV2病毒的蛋白组装而成的空壳结构，能够通过和正常病毒感染一样的途径递呈给免疫细胞，诱导免疫系统产生免疫保护反应，使得本发明的杂交瘤细胞分泌得到的单克隆抗体相比PCV2抗原蛋白单克隆抗体具有更高特异性和灵敏度。
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公开(公告)号：CN104073473A
公开(公告)日：2014-10-01
申请号：CN201410145870.8
申请日：2014-04-11
Applicant: 美国普赛生物高科技有限责任公司 , 湖南农业大学
Abstract: 本发明公开了一种PCV2病毒样颗粒及其制备方法和裂解及VLP组装缓冲液。基于自主优化设计，并人工合成适合在原核表达系统中高效表达的PCV2核衣壳蛋白基因，通过大肠杆菌原核表达系统表达PCV2核衣壳蛋白的全长基因序列，并利用其可溶性核衣壳蛋白在特定条件下高效自体组装成了病毒样颗粒。本发明创新点主要在于采用不同于常规的真核表达系统获取VLPs方法，而是利用原核表达系统获取PCV2VLPs，本方法成本低廉、简单高效，适合大规模产业化应用；其中还应用到独创的既可以促进菌体裂解又能适合VLPs自体组装的双功能于一体的缓冲液配方；另外发明所获得的PCV2病毒样颗粒与野生型病毒外形相似度高，并且免疫原性好，可以用于研发具有应用潜力的猪圆环病毒的亚单位疫苗及药物传递载体。
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公开(公告)号：CN119307595A
公开(公告)日：2025-01-14
申请号：CN202411393650.7
申请日：2024-10-08
Applicant: 湖南农业大学
IPC: C12Q1/6844 , C12Q1/70 , C12N15/11 , C12R1/93
Abstract: 本发明属于生物技术领域，涉及一种LAMP‑CRISPR检测体系及其应用。所述LAMP‑CRISPR检测体系包括LAMP扩增体系和CRISPR检测体系，所述LAMP扩增体系包括特异性扩增PEDV、TGEV、PDCoV和PoRV G9的引物；CRISPR检测体系包括Cas蛋白、crRNA‑F/R和ssDNA探针；所述crRNA‑F/R序列如SEQ ID NO.23‑28、SEQ ID NO.29‑34、SEQ ID NO.35‑40或SEQ ID NO.41‑42所示；ssDNA探针的序列如SEQ ID NO.43‑44所示。本发明通过体系的优化，有效解决了多重检测体系检测的准确度不高的问题。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN108410907B
公开(公告)日：2021-08-27
申请号：CN201810192797.8
申请日：2018-03-08
Applicant: 湖南农业大学
Abstract: 一种基于CRISPR/Cas9技术实现HMGCR基因敲除的方法，是设计两个针对HMGCR基因的CRISPR/Cas9靶标序列，体外合成gRNA单链，经过退火处理获得两个gRNA双链DNA目的插入片段，并分别插入PX459(pSpCas9(BB)‑2A‑Puro)V2.0载体中，获得靶向HMGCR基因两个不同位点的质粒；分别转染该两质粒至PK15细胞中，以嘌呤霉素处理细胞，提取处理后的细胞基因组DNA进行PCR扩增，PCR产物变性、退火后再利用T7E1进行HMGCR基因敲除鉴定。本方法能用于分析HMGCR基因敲除后的序列和mRNA表达情况，能利用PCR结合T7E1酶处理方法验证有无脱靶现象，从而确定基于靶标序列HMGCR‑gRNA的特异性。本方法不仅可应用于细胞、动物模型中实现HMGCR基因的定点敲除，而且对于实现其它基因的敲除具有参考价值，并具有效果好、简便、经济、时间短等优点。
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公开(公告)号：CN109265521B
公开(公告)日：2021-05-18
申请号：CN201811067175.9
申请日：2018-09-13
Applicant: 湖南农业大学
IPC: C07K14/01 , C07K19/00 , C12N15/11 , C12N15/70 , G01N33/68 , G01N33/569 , A61K39/12 , A61K39/23 , A61P31/20
Abstract: 本发明公开了一种PCV2Loop EF区的突变体、引物及其制备方法和应用，PCV2Loop EF区的突变体，其Loop EF区第133位丙氨酸形成供外源表位替换和/或插入的可突变位点以便在体外组装成完整的VLPs。电镜结果表明，Loop EF中第133位氨基酸的突变不影响VLPs组装，表明PCV2VLPs Loop EF区展示外源抗原表位具有可行性。为Loop EF区结构功能研究奠定基础，同时也为展示外源表位构建嵌合型多价疫苗研究提供重要的实验依据。
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公开(公告)号：CN110724661A
公开(公告)日：2020-01-24
申请号：CN201910644544.4
申请日：2019-07-17
Applicant: 湖南农业大学
IPC: C12N5/071
Abstract: 本发明提供了一种小鼠原代肝细胞的分离方法及其制得的小鼠原代肝细胞与应用，涉及原代细胞分离技术领域。小鼠原代肝细胞的分离方法，包括如下步骤：将麻醉小鼠依次进行腹腔暴露、肝周管结扎、原位三步灌流和细胞分离得到小鼠原代肝细胞；原位三步灌流依次包括第一灌流，第二灌流和第三灌流；第一灌流，用第一灌流液去除红细胞，并对血液进行抗凝；第二灌流，用第二灌流液去除抗凝剂，并对肝组织进行初步消化；第三灌流，用第三灌流液进一步消化。该小鼠原代肝细胞的分离方法缓解了现有技术中缺乏一种分离后细胞活性高、贴壁迅速、存活细胞收率高、分离成本低并且分离过程不易污染的小鼠原代肝细胞分离方法的技术问题。
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公开(公告)号：CN106434750A
公开(公告)日：2017-02-22
申请号：CN201610850055.0
申请日：2016-09-26
Applicant: 湖南农业大学
CPC classification number: C12N15/8509 , C12N2800/107 , C12N2800/30
Abstract: 本发明公开了靶向打靶载体及靶向整合外源基因至MYH9Intron2位点构建小鼠胚胎干细胞株的方法和应用。所述靶向打靶载体序列如SEQ ID NO.7所示，命名为mpNTKV-LoxP MAI2L-MAI2R载体。本发明提供了一个新的能实现高效、安全、靶向整合的位点序列，基于该位点构建的靶向插入外源基因的打靶载体，不仅可实现高效打靶，而且能够保证外源基因在小鼠胚胎干细胞中稳定表达而内源基因表达不受影响，从而为构建转基因细胞系以及小鼠搭建了一个好的平台。
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公开(公告)号：CN105907752A
公开(公告)日：2016-08-31
申请号：CN201610300662.X
申请日：2016-05-09
Applicant: 湖南农业大学
CPC classification number: C12N15/11 , C12N7/00 , C12N15/10 , C12N2750/10052 , C12Q2531/125
Abstract: 本发明公开一种基于体外滚环复制的PCV2毒株感染性克隆构建试剂盒及方法。所述基于体外滚环复制的PCV2毒株感染性克隆构建试剂盒中含有如下引物：PCV2特异性上游引物：5’?CCATATGAAATAAATTACTGAG?3’（SEQ ID NO.1）；PCV2特异性下游引物：5’?CAGCGCACTTCTTTCGTTTTCAG?3’（SEQ ID NO.2）；随机引物：5′?NNNNNN?3′（SEQ ID NO.3）。PCV2毒株感染性克隆的方法是利用上述引物对PCV2 DNA进行多引物滚环扩增后得到PCV2全基因组，然后将全基因组通过单酶切分离纯化后连接，并重新环化，构建成PCV2毒株感染性克隆。
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