公开(公告)号：CN115109791A

公开(公告)日：2022-09-27

申请号：CN202210710412.9

申请日：2022-06-22

Applicant: 华南农业大学

Inventor： 孙坚 ,  周士迎 ,  龙腾飞 ,  李龚 ,  何玉张 ,  万磊 ,  黄紫蕾 ,  刘雅红 ,  廖晓萍

IPC: C12N15/70 ,  C12N15/74 ,  C12N15/65 ,  C12N15/12 ,  C12N15/55

Abstract: 本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种基于IncQ型质粒泛宿主的功能基因递送载体、构建方法和应用。本发明以pLHM‑10‑1质粒为模板，在mob区和rep区处设计引物进行PCR扩增，以pUC19质粒为模板，在Amp区设计引物进行PCR扩增，将扩增产物进行电泳纯化回收，两片段进行重组，转化至大肠杆菌E.Coli Dh5α感受态细胞复苏，再将其涂布于含有氨苄西林(ampicillin，AMP)的培养基上，挑取单菌落，进行菌落PCR，测序验证得到所述递送载体。本发明的载体质粒具有体积小，宿主范围广，可搭载的功能基因种类丰富、抗性标记替换较为简便等优势，适用于不同功能基因的泛宿主递送。

公开(公告)号：CN110079540A

公开(公告)日：2019-08-02

申请号：CN201910282837.2

申请日：2019-04-10

Applicant: 华南农业大学

Inventor： 孙坚 ,  李龚 ,  何玉张 ,  刁晓苑 ,  于泳鑫 ,  刘雅红 ,  廖晓萍

IPC: C12N15/63 ,  C12N15/65 ,  C12N1/21 ,  C12R1/19 ,  C12R1/01 ,  C12R1/22 ,  C12R1/42

Abstract: 本发明共公开了一种基于mariner转座子构建自杀型质粒及耐药突变菌株的方法。该自杀型质粒的构建包括如下步骤：以pCat-marinerr质粒为模板进行PCR扩增，将获得的扩增产物作为质粒骨架；然后以pUC57-tpm质粒为模板扩增tpm抗性基因，再将质粒骨架和tpm抗性基因进行同源重组，得到所述自杀型质粒。本发明中的耐药突变菌株是将自杀型质粒转化大肠杆菌WM3064感受态细胞，然后将获得菌株和目标菌株混合培养，再用含有亚碲酸盐的单药板、以及含有亚碲酸盐和原抗性筛选标记药物的双药板进行筛选，得到耐药突变菌株。本发明方法操作简单，可高通量的获得转座突变株，适用于构建耐药菌株或筛选药物。

公开(公告)号：CN110117605B

公开(公告)日：2021-02-19

申请号：CN201910282847.6

申请日：2019-04-10

Applicant: 华南农业大学

Inventor： 孙坚 ,  何玉张 ,  李龚 ,  刘苹 ,  江颖琳 ,  许金霞 ,  刘雅红 ,  廖晓萍

IPC: C12N15/70 ,  C12N15/74 ,  C12N15/66 ,  C12N15/65 ,  C12N1/21 ,  C12R1/19 ,  C12R1/22 ,  C12R1/42

Abstract: 本发明公开了一种基于IS26插入序列构建能表达荧光的自杀型质粒及菌株的方法。该自杀型质粒的构建方法如下：通过AflII和XhoI双酶切pUC26‑tpm质粒和pUC26‑RP4质粒，然后将电泳后回收的产物用连接酶连接，构建p26‑RP4质粒；然后通过EcoRI和Spel双酶切p26‑RP4质粒和pBBR1MCS4‑LuxCDAB质粒，再将电泳后回收的产物用连接酶连接，构建能表达荧光的自杀型质粒。将本发明中获得的自杀型质粒转化大肠杆菌WM3064感受态细胞，得到荧光标记的大肠杆菌；最后将其与目标菌株共培养，可构建荧光菌株。本发明方法效率高，可用于构建耐药菌株、药动药效学评价或筛选药物中。