本发明提供了一种少动鞘氨醇单胞菌CRISPRi/dCas12a基因调控系统及其构建方法和应用，具体属于基因工程技术领域。本发明的基因调控系统包括pBBR1‑dCas12a‑crRNA质粒，所述质粒包括pBBR1复制子、dCas12a基因、crRNA表达盒和氯霉素抗性基因；所述crRNA表达盒包括一个Ptac启动子、两个DR片段和一个rrnB T1终止子。本发明所述系统能够在少动鞘氨醇单胞菌中稳定表达，抑制基因的转录，来降低特定基因的表达，而不修改其DNA序列，对S.paucimobilis有较小的毒性，宿主生长速度快，且能够实现dcas12a的高效表达。