本发明涉及生物工程技术领域，具体公开了一种利用甘蔗糖蜜生产ε‑聚赖氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明以小白链霉菌PD‑1(Streptomyces albulus PD‑1)为宿主，使用含有强启动子的整合型表达载体pSET152进行蔗糖‑6‑磷酸水解酶编码基因(cscA)的异源表达，构建了能够直接利用甘蔗糖蜜中总糖进行ε‑聚赖氨酸合成的重组菌株。进一步通过高浓度甘蔗糖蜜适应性进化策略和发酵罐放大培养，实现了ε‑聚赖氨酸的高效发酵合成。相比于传统发酵工艺，本工艺构建的重组菌株可直接利用非粮原料甘蔗糖蜜发酵生产ε‑聚赖氨酸，能够有效提高廉价碳源的利用率，具有较好的工业经济化潜力。