本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种PCR扩增引物对和探针及其应用。PCR扩增引物对的上游引物包含如SEQIDNO：1所示序列，下游引物包含如SEQIDNO：2所示序列，探针包含如SEQIDNO：3所示序列。该PCR扩增引物对和探针对耐热芽孢杆菌的特异性强，20个循环左右(约1h)就可以起线，检测时间短；检测限可以达到0.75CFU/mL，灵敏度高；而且在探针的作用下，在PCR过程中可以实时监控PCR扩增的情况，且前期不需要增菌，后续不需要凝胶电泳，简化了操作步骤，更有利于检测。