本发明提供了一种催化葡萄糖合成D‑阿洛酮糖的融合蛋白及其构建方法，涉及生物化工领域。为了避免双酶催化体系中中间产物扩散带来的转化效率低等问题，本发明构建了由不同长度连接肽连接的融合蛋白，通过构建底物通道提高转化效率。具体的，使用不同长度的柔性连接肽和刚性连接肽将葡萄糖异构酶基因和D‑阿洛酮糖3‑差向异构酶连接起来，结果表明，D阿洛酮糖的合成效率随着连接肽长度的增加而提高，且刚性连接肽优于柔性连接肽。本发明所提供的融合蛋白通过底物通道将中间产物传递给下一个酶，减少了中间产物扩散，提高了D‑阿洛酮糖的合成效率。