本发明公开一种无标记三维超分辨显微方法，包括步骤：利用实心照明光束和空心照明光束对无标记样品同时进行二维扫描，得到由实心光斑调制得到的正共聚焦反射光强度图和由空心光斑调制得到的负共聚焦反射光强度图，并进行差分计算；采用差动测量扫描方法对样品进行扫描测量实现轴向超分辨，一个光电探测器置于焦平面的离焦距离‑uM处，另一个光电探测器置于焦平面的离焦距离+uM处，分别测得反映样品表面形貌变化大小的强度曲线，进行差动相减并进行归一化处理，后得到一个差分强度信号；根据强度曲线在零点附近AB线性测量范围内的光强大小，重构出样品表面形貌和微观尺度；并得到三维超分辨显微图像。