本发明提供一种自对准式原位表征芯片，包括衬底层，衬底层的正反面设有第一和第二绝缘层，第一绝缘层的正面设有覆盖于第一绝缘层的一部分上的一功能层以及覆盖于第一绝缘层的一部分外露部分上和功能层的一部分上的第三绝缘层；一部分第一绝缘层外露于第三绝缘层和功能层，且一部分功能层外露于第三绝缘层，以形成样品窗口；第二绝缘层上设有对准样品窗口的透射窗口。本发明还提供其制备和使用方法。该表征芯片使得待测样品可以通过该样品窗口与功能层自对准连接，从而规避制样、转移样品至表征芯片的操作，消除了相应过程中样品被污染和损伤的可能性。