本发明公开了一种丁二酰亚胺的生物制备方法，包括：黑曲霉菌粉与丙酮，回流提取得黑曲霉孢子粉提取液，减压浓缩、石油醚萃取，再经减压浓缩至石油醚挥干，得粗提物硅胶柱层析得不同浓缩液；Sephadex LH‑20凝胶柱层析得不同浓缩组分；再次Sephadex LH‑20凝胶柱层析，通过薄层层析色谱分析，观察5%的浓硫酸乙醇溶液和0.8%磷钼酸乙醇溶液的显色情况,选取物质成点情况和Rf值相同的流分合并，减压浓缩至有机溶剂挥干；选取在石油醚:丙酮=2:1展开条件下Rf值在0.3‑0.5的流分，在乙酸乙酯:甲醇=1:50的混合溶剂中进行重结晶，结晶后收集晶体即为丁二酰亚胺。本发明底物廉价易得，提取工艺简单、易行，生产过程环保、溶剂残留少、污染低。