本发明涉及一种芋螺毒素多肽Eb1.6的制备方法。本发明公开了一种制备芋螺多肽Eb1.6的方法。本发明提供的方法，包括如下步骤：1）采用缩合剂DIC/HOBt合成Eb1.6线性肽；2）折叠所述线性肽，即得到芋螺多肽Eb1.6。本发明的方法首先采用缩合剂DIC/HOBT提高了手工合成线性肽的效率；再选取pH值为8.0、浓度为0.1MNH4HCO3缓冲液作为折叠缓冲液，不仅价廉易得，而且折叠率高；再将折叠得到的产物经过AmberliteXAD16大孔吸附树脂进行吸附、乙醇浸洗，浸洗液浓缩后可直接用于后续的C18柱纯化，同时乙醇洗涤后的树脂用水洗涤再生，此步骤可实现缓冲体系及树脂的反复循环使用，回收率较高，降低了成本。