本发明涉及一种胆固醇氧化酶亲和介质，由胆固醇氧化酶亲和配体和层析介质连接而成，较佳地，胆固醇氧化酶亲和配体是FAD片段核黄素，所述层析介质是Sepharose、壳聚糖或聚苯乙烯，还提供了上述胆固醇氧化酶亲和介质的合成方法，以及利用上述的胆固醇氧化酶亲和介质大规模纯化胆固醇氧化酶的方法，利用本发明的胆固醇氧化酶亲和介质可以大规模快速分离纯化胆固醇氧化酶，可在仅用一步亲和层析的情况下，得到胆固醇氧化酶纯品，整个纯化步骤消耗时间段，蛋白和活性回收率较高，适于大规模推广应用。