公开(公告)号：CN103409365A

公开(公告)日：2013-11-27

申请号：CN201310400091.3

申请日：2013-09-05

Applicant: 中国科学院昆明动物研究所

Inventor： 王晓爱 ,  潘晓赋 ,  杨君兴 ,  刘倩 ,  陈小勇

IPC: C12N5/071 ,  A01N1/02

Abstract: 本发明涉及一种短须裂腹鱼心脏细胞系的构建和超低温冷冻保存的方法，属于淡水水生生物细胞培养和超低温冷冻保存技术领域。该方法是以短须裂腹鱼心脏组织为材料，采用组织块法和两酶消化法，在含有胎牛血清和细胞生长因子，pH值为7.0-7.2 的M199培养液中培养；采用胰蛋白酶消化法进行传代培养；具体包括制备细胞培养液、原代培养及传代培养步骤。本发明的有益效果在于：1、操作简便；2、降低了纯组织块法对心脏细胞的损伤；3、构建的短须裂腹鱼心脏细胞系形态为成纤维样，生长状态良好，能够连续传代并直接应用于生物学特性研究，满足了对短须裂腹鱼种质资源保存和理论研究及应用的需要；4、该构建方法也适用于其他鱼类构建心脏细胞系。

公开(公告)号：CN102766595A

公开(公告)日：2012-11-07

申请号：CN201210288477.5

申请日：2012-08-07

Applicant: 中国科学院昆明动物研究所

Inventor： 潘晓赋 ,  王晓爱 ,  杨君兴 ,  陈小勇

IPC: C12N5/077

Abstract: 本发明涉及一种鱇浪白鱼心脏细胞系的构建方法，属于淡水生物细胞培养技术领域。该方法以鱇浪白鱼心脏组织为材料，清洗剪碎后，采用透明质酸酶和II型胶原酶联合消化获得游离心脏细胞和疏松组织块，接种于25cm2培养瓶中，加入含有胎牛血清、人碱性成纤维细胞生长因子和硫酸软骨素的L-15培养液，置于28℃培养箱培养。每隔3天半更换培养液，待细胞长成单层后，采用胰蛋白酶消化法进行传代。本发明的有益效果在于：1、操作简便；2、构建的鱇浪白鱼心脏细胞系的细胞生长状态良好，形态为成纤维样细胞，能连续传代40代以上，直接用于环境毒理学研究环境污染物的模型，进行污染检测和安全性评价；3、该方法也适用于其他鱼类构建心脏细胞系。

公开(公告)号：CN102763640A

公开(公告)日：2012-11-07

申请号：CN201210277522.7

申请日：2012-08-07

Applicant: 中国科学院昆明动物研究所

Inventor： 王晓爱 ,  潘晓赋 ,  杨君兴 ,  陈小勇

IPC: A01N1/02

Abstract: 一种暗色唇鱼精子超低温冷冻保存方法，属于低温生物学技术领域。本发明的方法为：选择达到性成熟的优质原种或良种，用100ppm的MS-222麻醉5min，轻轻挤压擦干的腹部，成熟的精液流入5mL离心管中，检测鲜精活力，活力在85%以上的精液样品用于精子冷冻。将采集的优质精液与抗冻液（D-15+5%甲醇）按三步稀释法稀释，使精子终密度为2.5×108个/mL，分装入1.8ml冻存管中，4℃平衡30min，液氮面上6cm平衡10min，液氮面上平衡5min后投入液氮中保存。使用时将保存的精子在40℃水浴中解冻，进行人工授精。本发明具有成本低，操作简便，保持时间长，复苏后精子的活力较高，人工繁殖的暗色唇鱼的受精率和孵化率较高，能投入规模生产的优点；对于开展鱼类资源恢复与重建也具有重要意义。

公开(公告)号：CN102757933A

公开(公告)日：2012-10-31

申请号：CN201210277865.3

申请日：2012-08-07

Applicant: 中国科学院昆明动物研究所

Inventor： 王晓爱 ,  杨君兴 ,  潘晓赋 ,  陈小勇

IPC: C12N5/071 ,  C12R1/91

Abstract: 本发明涉及一种鱇浪白鱼肌肉细胞系的构建方法，属于淡水生物细胞培养技术领域。该方法首先配制细胞培养液，以鱇浪白鱼肌肉组织为材料，清洗剪碎后，接种于25cm2培养瓶中，置于28℃培养箱培养。每隔3天半量更换培养液，待细胞长成单层后，采用胰蛋白酶消化法进行传代。5天传代一次，传至第10代时，培养液中血清浓度降至10%，此时细胞系建立成功。本发明的有益效果在于：1、操作简便易行；2、所构建的鱇浪白鱼肌肉细胞系（AGM）细胞生长状态良好，形态为成纤维样细胞，能连续传代50代以上，能直接用于鱇浪白鱼细胞生物学特性及免疫抗病基因功能的研究；3、该构建方法也适用于其他鱼类肌肉细胞系。

公开(公告)号：CN101554144A

公开(公告)日：2009-10-14

申请号：CN200910094486.9

申请日：2009-05-22

Applicant: 中国科学院昆明动物研究所

Inventor： 杨君兴 ,  潘晓赋 ,  李再云 ,  陈小勇 ,  崔桂华

IPC: A01K61/00

CPC classification number: Y02A40/81

Abstract: 本发明涉及一种滇池金线鲃的人工受精及孵化方法，属鱼产品养殖技术领域。该方法由干法受精和人工孵化组成。对性成熟金线鲃亲鱼用马来酸地欧酮按每公斤体重1mg和促黄体素释放激素A2按每公斤体重1μg进行肌肉注射，注射24小时后分别将卵、精成熟的雌、雄滇池金线鲃的卵子和精子从其腹部轻轻压挤出，在器皿中用鸡毛轻轻搅拌30秒，再加入清水搅拌20秒，再经三次清水清洗干净，然后均匀泼洒粘附在已经清洗消毒杀菌处理的棕片上，放入5ppm霉菌净溶液中浸泡消毒15分钟，取出放入20m2或50m2的孵化池中进行孵化，在水温18～20℃，pH7.5～8.0的条件下，用氧气泵增氧进行孵化，经150小时后完成孵化。本发明具有成本低、操作简便，能投入产业化、集约化生产，受精率及孵化率高的优点。