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公开(公告)号：CN100413968C
公开(公告)日：2008-08-27
申请号：CN200610052588.0
申请日：2006-07-21
Applicant: 浙江大学
Abstract: 本发明公开了一种能催化吲哚生成靛蓝的P450BM-3Glu435Thr变体基因，利用饱和突变定向进化技术介导的随机突变，筛选获得，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，原P450BM-3(F87V/A74G/L188Q)基因中的第435位的谷氨酸的密码子突变为苏氨酸的密码子。所得到的变体基因表达的变体酶通过酶动力学曲线的测定，与现有技术相比较，催化效率显著提高，为生物合成染料靛蓝提供了更加具有应用价值的新酶，同时为染料靛蓝的生物生产提供了更加广阔的应用前景。
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公开(公告)号：CN1900287A
公开(公告)日：2007-01-24
申请号：CN200610052588.0
申请日：2006-07-21
Applicant: 浙江大学
Abstract: 本发明公开了一种能催化吲哚生成靛蓝的P450BM－3Glu435Thr变体基因，利用饱和突变定向进化技术介导的随机突变，筛选获得，其碱基序列如序列表中SEQ ID NO.1所示，原P450BM－3(F87V/A74G/L188Q)基因中的第435位的谷氨酸的密码子突变为苏氨酸的密码子。所得到的变体基因表达的变体酶通过酶动力学曲线的测定，与现有技术相比较，催化效率显著提高，为生物合成染料靛蓝提供了更加具有应用价值的新酶，同时为染料靛蓝的生物生产提供了更加广阔的应用前景。
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公开(公告)号：CN1880459A
公开(公告)日：2006-12-20
申请号：CN200610050388.1
申请日：2006-04-18
Applicant: 浙江大学
Abstract: 本发明公开了一种能共表达P450BM3和葡萄糖脱氢酶，并能催化吲哚合成靛蓝的质粒pET28a(+)－P450BM3－gdh0310、制备方法及其用途。它是将P450BM3基因和葡萄糖脱氢酶基因共同连接在同一个表达载体pET28a(+)上，将此质粒转入E.coliBL21，得到的菌株能同时表达细胞色素P450BM3单加氧酶和葡萄糖脱氢酶，并能协同作用催化吲哚生成靛蓝，与以往菌株相比，其催化活性提高了22－27倍，为生物转化生产染料靛蓝提供了广阔的应用前景。
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公开(公告)号：CN1683544A
公开(公告)日：2005-10-19
申请号：CN200510049187.5
申请日：2005-03-07
Applicant: 浙江大学
Abstract: 本发明公开了一种生物合成γ－氨基丁酸的方法，其特征在于，保藏编号为：CGMCC NO.1306的短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，经琼脂斜面培养基活化后，转接于GYP种子培养基或MRS种子培养基，培养10～30小时后，以0.5％～5％的接种量接种于GYP或MRS发酵培养基中，在25℃～35℃下静置培养48h～120h，即得含菌体的发酵液，菌体离心分离收集；离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤，取0.25～2g湿菌体，悬浮于15～50mL的柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲体系中，L－谷氨酸钠含量为5mM～60mM，反应1～10小时，反应液离心即得含γ－氨基丁酸的溶液。本发明生产成本低、反应条件温和、环境污染小、方法简单、易于操作，生产效率高，并且产品纯度较高，减轻了后续分离纯化工艺。
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公开(公告)号：CN1597947A
公开(公告)日：2005-03-23
申请号：CN200410053250.8
申请日：2004-07-22
Applicant: 浙江大学
Abstract: 本发明公开了一种NaCS－PDMDAAC微胶囊固定化细胞色素P450 BM－3的制备方法。它是在0～10℃温度下，按质量比6～15∶100将细胞色素P450 BM－3粗酶液混匀于质量分数为3.6～5.1％的纤维素硫酸钠(NaCS)，用4～7号针头滴入2～3倍体积质量分数为4～8％的聚二甲基二丙烯基氯化铵(PDMDAAC)中，再继续搅拌30～60min，然后用去离子水或缓冲液洗涤三次，吸干即可。本发明的优点是：操作简便，条件温和；固定化酶稳定性好；能用于生物反应器，具有工业应用的前景。
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Patent Agency Ranking
公开(公告)号：CN1526729A
公开(公告)日：2004-09-08
申请号：CN03151272.0
申请日：2003-09-25
Applicant: 浙江大学
IPC: C07K14/435 , C07K14/47 , C07K1/36
Abstract: 本发明公开了一种以疏水作用层析为主要手段的分离纯化重组细胞色素P450bm－3的方法。它的纯化步骤由粗酶液的制备、疏水层析和凝胶层析组成，其中在工程菌发酵中，将保存的表达P450bm－3的大肠杆菌经种子培养基活化、发酵培养基发酵，细胞色素P450bm－3在大肠杆菌细胞内表达；在粗酶液的制备时，将发酵培养基离心收集菌体，超声波破碎菌体，离心后取上清液，然后进行(NH4)2SO4分级沉淀，再用含(NH4)2SO4的缓冲液复溶；在疏水层析分离时，将复溶液加到疏水层析柱中进行吸附，收集含P450bm－3的洗脱峰；最后通过凝胶层析分离，将收集的洗脱液加入凝胶层析柱中，收集含P450bm－3的活性洗脱峰，纯度达到90％以上，活性回收率13.5％，纯化倍数13.7，本发明具有作用条件温和、成本低、工艺简单、操作方便、生产周期短等优点。
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公开(公告)号：CN107312787B
公开(公告)日：2020-04-14
申请号：CN201710586367.X
申请日：2017-07-18
Applicant: 浙江大学宁波理工学院
Abstract: 本发明公开了一种融合蛋白基因、工程菌及其在制备9α‑羟基‑雄烯二酮中的应用，其中，所述融合蛋白基因包括编码3‑甾酮‑9α‑羟基化酶的基因和编码细胞色素P450 BM‑3酶中黄素域的基因。本发明将3‑甾酮‑9α‑羟基化酶在大肠杆菌中异源表达，并通过基因重组技术，将3‑甾酮‑9α‑羟基化酶与细胞色素P450 BM‑3酶的黄素域进行融合表达，得到融合蛋白KshA‑P450，并使用含有该融合蛋白的重组工程菌催化底物雄烯二酮制备9α‑羟基‑雄烯二酮，不仅提高了比活力，同时也提高了转化率。
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公开(公告)号：CN103031323B
公开(公告)日：2014-10-08
申请号：CN201110297904.1
申请日：2011-09-30
Applicant: 浙江大学宁波理工学院
Abstract: 本发明涉及一种谷氨酸脱羧酶热稳定变体G56P基因，其核苷酸序列在第56位有定点突变。研究发现，此位点突变后得到的变体基因编码的谷氨酸脱羧酶的热稳定性有所增强。本发明通过在编码野生GAD酶基因基础上进行定点突变，提高了其对应变体酶在在60℃和70℃下的热稳定性。随着酶热稳定性的提高，在工业生产过程中可以采用更高的操作温度，以提高反应速率、增加底物溶解度，有利于利用该酶通过生物转化生产GABA。
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公开(公告)号：CN103789246A
公开(公告)日：2014-05-14
申请号：CN201410005932.5
申请日：2014-01-03
Applicant: 浙江大学宁波理工学院
Abstract: 本发明公开了一种透性化谷氨酸脱羧酶工程菌及其制备方法，所述方法包括：将已表达谷氨酸脱羧酶的谷氨酸脱羧酶工程菌菌体悬浮于水或缓冲液中，50～70℃处理5～40min后，收集菌体，得到所述的透性化谷氨酸脱羧酶工程菌；其中，所述的谷氨酸脱羧酶工程菌包括宿主细胞和转入宿主细胞的谷氨酸脱羧酶基因，所述的宿主细胞为大肠杆菌。本发明还提供了所述方法得到的透性化谷氨酸脱羧酶工程菌。本发明的方法，简便、成本低，易于操作，可有效提高菌体的谷氨酸脱羧酶表观催化活力。
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公开(公告)号：CN103773731A
公开(公告)日：2014-05-07
申请号：CN201410005648.8
申请日：2014-01-03
Applicant: 浙江大学宁波理工学院
Abstract: 本发明公开了一种提高谷氨酸脱羧酶重组工程菌表观催化活力的方法，包括：将谷氨酸脱羧酶重组工程菌接种至培养基中，振荡培养，获得种子液；将种子液接种至培养基中，振荡培养至OD600为0.6～0.8时，加入诱导剂进行诱导培养，加入诱导剂的同时向培养基中加入细胞壁合成抑制剂或者表面活性剂来干扰重组菌细胞壁或（和）细胞膜的合成，达到增强菌体通透性、提高菌体表观催化活力的目的；诱导培养结束后收集菌体，即得到表观催化活力提高的谷氨酸脱羧酶重组工程菌。本发明避免了常规菌体培养后再进行透性化处理所需的多步工艺步骤，为改善高谷氨酸脱羧酶重组工程菌表观催化活力提供一种简便、高效和低成本的方法。
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