本发明公开一种酶法制备β‑烟酰胺单核苷酸的方法，属于生物技术领域。本发明以D‑核糖、烟酰胺、腺嘌呤核苷三磷酸ATP为原料，以核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸激酶以及烟酰胺磷酸核糖转移酶催化合成NMN，同时反应体系引入了多聚磷酸激酶和多聚磷酸盐形成了ATP的再生循环，引入了焦磷酸水解酶水解PPi，保证了ATP循环利用的同时，消除了副产物ADP和PPi对产率产生的不利影响；并利用AMP核苷酶构建了AMP回收系统，将副产物AMP转化成5磷酸核糖，进而转化为PRPP，实现了在不额外投料的条件下增加PRPP的合成途径，进一步增加NMN合成效率。该发明最终获得NMN的产率达90％以上，实现了低酶量条件下高效合成NMN。