本发明公开了一种尿苷二磷酸的制备方法，涉及尿苷二磷酸生产技术领域，通过在选择培养基中加入1％的尿苷和0.5％的尿苷一磷酸，筛选出能够提高尿苷二磷酸转化率的高质量菌体，菌体发酵培养后进行破碎并与尿苷一磷酸、ATP、Mg2+、poly‑p转化，得到含UDP的转化液，最后依次通过陶瓷膜、超滤膜过滤，再过阳离子树脂柱和氯型阴离子交换树脂进行脱盐和纯化，最后用纳滤膜浓缩和醇沉法得到高纯度的UDP。提高了UDP的转化率，简化了纯化流程，降低了生产成本，为UDP的大规模生产和应用提供了有力支持。