本发明公开了检测原发突变位点为m.3460G>A的Leber遗传性视神经病变的组合物、试剂盒及应用。基于CRISPR/Cas12的一步法检测Leber遗传性视神经病变的组合物，所述组合物包含crRNA和RPA扩增引物对；所述crRNA的序列为如SEQ ID NO:6所示的序列，并且所述RPA扩增引物对为如SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24所示的序列组成的引物对；所述Leber遗传性视神经病变的原发突变位点为m.3460G>A。本发明提供的组合物和试剂盒可以对LHON基因突变进行快速诊断，一步法快速实现对LHON致病突变的快速检测，精准地检测样品的LHON致病三个原发突变位点m.3460G>A是否存在，具有检测快速、操作简便(一步法)、特异性、可视化，无需大型贵重仪器和昂贵试剂等特点。