本发明公开了一种稳定外分泌表达猪流行性腹泻病毒S蛋白的CHO细胞系的构建方法，属于基因工程技术领域。本发明通过设计合成9个信号肽引物，以同源重组的方式得到表达猪流行性腹泻病毒变异株AH2012/12株S全长蛋白的9个重组表达质粒，瞬时转染HEK 293T细胞后，通过Western‑blot验证蛋白外分泌表达水平，筛选出含跨膜蛋白酶丝氨酸9信号肽S蛋白具有较好的外分泌表达特性；随后利用G418筛选获得稳定表达猪流行性腹泻病毒S蛋白的单克隆细胞，通过传代验证不同代次的蛋白表达水平，成功构建了可稳定外分泌表达猪流行性腹泻病毒S蛋白的CHO细胞系，为进一步研制猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗奠定了基础。