本发明公开了一种改造酿酒酵母菌以葡萄糖为底物合成活性VD3的方法，属于生物技术领域。本发明通过导入DHCR24，强化ERG1，ERG11，tHMG1，ERG7，ERG2，敲除ERG6基因，并通过导入不同的羟化酶确定最合适的维生素D3羟化酶，发现在酵母中VDH无需提供额外的电子传递链便可以发挥作用，将合成的VD3转化为25‑OH‑VD3，并且合成25‑OH‑VD3的量是suaC的5倍。在以葡萄糖为底物的发酵生产中，最终合成5.02mg/L的活性体25‑OH‑VD3，解决了现有技术中仅能以VD3作为底物转化活性体25‑OH‑VD3的问题。